论文摘要
目的:构建含HIV-1 vpr基因的重组腺病毒rAd-vpr,通过重组腺病毒感染,在人T细胞白血病病毒1型转化细胞C8166内源性表达HIV-1 Vpr蛋白,研究表达Vpr蛋白诱导C8166细胞周期阻滞、细胞致死效应等功能;并在建立C8166细胞蛋白质组学研究的核心技术平台基础上,应用蛋白质组学的方法研究HIV-1 Vpr蛋白对C8166细胞蛋白质组的影响,进而由差异蛋白质推测Vpr蛋白对C8166细胞作用可能机制;从而探讨将重组腺病毒rAd-vpr用于成人T细胞白血病基因治疗的可能性。方法:将PCR扩增得到vpr基因片段插入穿梭载体pAdTrack-CMV,产生重组质粒pAdTrack-CMV-vpr,将经PineⅠ线性化后的重组质粒通过电转法导入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183进行同源重组,得到重组腺病毒质粒pAdEasy-vpr。用Lipofectamine 2000将pAdEasy-vpr转染到HEK-293A细胞,包装并扩增出大量的腺病毒。重组腺病毒感染C8166细胞,Western blotting检测重组Vpr蛋白在C8166细胞中内表达,重组腺病毒感染C8166细胞效率采用流式细胞术检测和荧光倒置显微镜观察。PI染色流式细胞术分析rAd-vpr感染C8166细胞对其细胞周期的影响;细胞凋亡的形态学检测采用Hoechst 33342/PI染色激光共聚焦显微镜观察,线粒体膜电势采用JC-1染色测定。制备三组（对照组、rAd-vector感染组和rAd-vpr感染组）细胞总蛋白。采用IPG预制胶条（pH4-7,17cm）进行第一维等电聚焦,10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行第二维分子量垂直电泳。采用PDQuest 7.4图像分析软件对获得的双向凝胶电泳图谱进行分析。选取12个重组腺病毒rAd-vpr感染后差异表达的蛋白质点,进行胶内酶切、串联飞行时间质谱（QSTARXL）分析,将采集的质谱数据通过MASCOT在线检索NCBInr数据库鉴定蛋白,并通过半定量RT-PCR检测差异表达蛋白质14-3-3和GSTP1在三组细胞中的mRNA水平。结果:成功构建了含HIV-1 wr基因的重组腺病毒rAd-vpr,可高效感染C8166细胞,表达HIV-1 Vpr蛋白,PI染色流式细胞术检测细胞周期结果显示,重组腺病毒rAd-vpr感染48h及72h,C8166细胞晚期凋亡率显著高于rAd-vector组及对照组,重组腺病毒rAd-vpr感染72h,能诱导C8166细胞G2/M期细胞周期阻滞。激光共聚焦显微镜观察Hoechst 33342/PI染色重组腺病毒rAd-vpr感染的C8166细胞出现了凋亡小体,JC-1染色重组腺病毒rAd-vpr感染C8166细胞线粒体膜电势下降。建立并优化了人T细胞白血病病毒1型转化细胞C8166细胞总蛋白的双向凝胶电泳方法,获得了蛋白质分离效果较好的双向凝胶电泳图谱。采用串联飞行时间质谱对选取的12个差异蛋白质点进行质谱分析,获得了相应的肽序列指纹图谱,通过MASCOT在线检索工具检索NCBInr数据库,鉴定这些差异蛋白质为细胞周期调控相关蛋白14-3-3,GSTP1及Galectin-1;肿瘤细胞转移相关的蛋白Rho GDI2;caspase-3激活示意蛋白vimentin和Rho GDI2;线粒体蛋白prohibitin;抗炎蛋白thioredoxin;肿瘤蛋白ProteinDJ-1;增强肿瘤杀伤效应蛋白Nucleoside diphosphate kinase A;与细胞骨架蛋白折叠相关的蛋白Tubulin specific chaperone A等。最后通过半定量RT-PCR在mRNA水平上验证了差异表达蛋白质14-3-3和GSTPl在重组腺病毒rAd-vpr感染的C8166细胞中表达上调。结论:通过细菌内同源重组成功构建了重组腺病毒rAd-vpr,通过重组腺病毒感染,在人T细胞白血病病毒1型转化细胞C8166内表达HIV-1 Vpr蛋白,表达Vpr蛋白能有效致C8166细胞死亡、线粒体丧失功能及细胞周期阻滞。运用蛋白质组学的研究手段发现细胞周期调控相关蛋白14-3-3,GSTP1及Galectin-1;肿瘤细胞转移相关的蛋白Rho GDI2;caspase-3激活示意蛋白vimentin和Rho GDI2;线粒体蛋白prohibitin;抗炎蛋白thioredoxin;肿瘤蛋白Protein DJ-1;增强肿瘤杀伤效应蛋白Nucleoside diphosphate kinase A;与细胞骨架蛋白折叠相关的蛋白Tubulin specificchaperoneA等参与了目的基因HIV-1 vpr导入C8166细胞后,细胞内表达的Vpr诱导细胞周期阻滞、凋亡等过程,描绘了一个更加清晰的Vpr致C8166细胞变化的细胞内蛋白网络图。通过半定量RT-PCR在mRNA水平上确证了两种差异表达蛋白质14-3-3和GSTP1在重组腺病毒rAd-vpr感染细胞中表达上调,可能与Vpr的细胞周期阻滞生物学功能相关。由于能够在诱导细胞发生凋亡的同时激活抗炎因子,使得严重的宿主免疫反应避免发生成为可能,因而重组腺病毒rAd-vpr在成人T细胞白血病的基因治疗中具有诱人的潜力和前景。
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相关论文文献
- [1].重组腺病毒HIV-1 vpr基因的构建和表达[J]. 免疫学杂志 2008(01)
- [2].RelB对HIV-1 Vpr转录激活及诱导细胞G2/M期停滞功能影响的初步研究[J]. 病毒学报 2013(01)