黑麦草抗冻蛋白基因的克隆、原核表达及植物转基因研究

论文摘要

抗冻蛋白（antifreeze protein,AFP）是一类能控制冰晶生长和抑制冰晶之间发生重结晶的蛋白质,能在低温结冰条件下保护生物体不受伤害。抗冻蛋白具有两种明显不同的抗冻活性--热滞（thermal hysteresis,TH）活性和重结晶抑制（recrystallizationinhibition,RI）活性。鱼类和昆虫抗冻蛋白的特征是高TH低RI活性,而植物抗冻蛋白的特征是低TH高RI活性。与鱼类和昆虫抗冻蛋白相比,植物抗冻蛋白更适合于植物转基因、食品冷冻保藏和细胞、组织、器官等的低温保存。耐寒性极强的常绿草本植物多年生黑麦草（Lolium perenne）内含活性较强的耐热的抗冻蛋白。本论文对黑麦草抗冻蛋白（LpAFP）的基因克隆、原核表达与纯化、结构分析与定点突变、植物过量表达载体构建进行了研究,结果如下：（1）黑麦草抗冻蛋白的基因克隆：对黑麦草进行冷胁迫处理后,提取叶片总RNA,采用RT-PCR法获得了黑麦草抗冻蛋白的cDNA克隆。序列分析结果表明,该cDNA的开放读码框（ORF）长度为357bp,编码一条由118个氨基酸组成的多肽。生物信息学分析结果表明,黑麦草成熟抗冻蛋白与禾本科的植物抗冻蛋白同源,有保守冰晶结合域,与鱼类和昆虫抗冻蛋白则没有同源性。（2）黑麦草抗冻蛋白的原核表达与纯化：把LpAFP的cDNA分别连接到pET32a和pET28a中,构建融合和非融合2种原核表达质粒,并在BL21（DE3）大肠杆菌中实现高效表达。获得优化培养诱导条件：在M9培养基中,诱导菌液起始光密度（OD600）为1.25,IPTG的终浓度为0.2μM,融合表达载体高效表达的诱导时间为6-8h；非融合也在此条件下实现高效表达。诱导表达的非融合表达蛋白通过100℃热处理、Ni-NTA亲和层析、反向HPLC三步分离纯化,获得大量高纯度有活性的LpAFP,可用于NMR测定LpAFP的高级结构。（3）黑麦草抗冻蛋白的结构分析与定点突变：LpAFP理论三维结构为一个大的右手β-螺旋结构,每一圈螺旋由2个β-折叠组成了一个相对平行的冰晶结合表面,每个折叠都有重复’XXNXVXG"基序,这个重复基序中关键氨基酸的改变将影响冰晶结合表面,可用于改进LpAFP的抗冻活性。采用交错PCR对LpAFP的cDNA序列进行定点突变,使其序列特征更加符合"XXNXVXG"重复基序特征,分别构建系列点突变的原核非融合表达质粒,诱导其高效表达。（4）黑麦草抗冻蛋白的植物过量表达质粒构建：采用交错PCR方法,分别将上游启动元件、增强子、LpAFP的cDNA、下游终止子等顺式作用元件进行体外连接、组装,并插入到植物表达载体pCAMBIO2301中,构建了LpAFP的植物过量表达载体,通过农杆菌介导法成功转入烟草,分子检测表明,LpAFP的cDNA整合到烟草基因组中并获得稳定遗传。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词
• 1. 绪论
• 1.1 抗冻蛋白的类别及活性
• 1.1.1 抗冻蛋白的类别及特性
• 1.1.2 抗冻蛋白的活性及检测
• 1.2 植物抗冻蛋白的结构及冰晶结合位点的研究
• 1.2.1 抗冻蛋白的作用模型--表面结合模型
• 1.2.2 胡萝卜抗冻蛋白的结构及其冰晶结合位点分析
• 1.2.3 黑麦草抗冻蛋白的结构和冰晶结合位点分析
• 1.3 植物抗冻蛋白的应用研究
• 1.3.1 植物抗冻蛋白的基因工程运用
• 1.3.2 植物抗冻蛋白在果蔬、食品、医学中的应用
• 1.4 本课题的目的、意义及技术路线
• 2 黑麦草抗冻蛋白基因的CDNA克隆
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 黑麦草总RNA提取
• 2.3.2 黑麦草抗冻基因的RT-PCR扩增
• 2.3.3 黑麦草抗冻蛋白基因的T-A克隆
• 2.3.4 黑麦草抗冻蛋白基因的序列分析
• 2.4 结论与讨论
• 3 黑麦草抗冻蛋白的原核表达与纯化
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料与试剂
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 黑麦草抗冻蛋白的表达载体构建及鉴定
• 3.3.2 黑麦草抗冻蛋白原核表达诱导条件的优化
• 3.3.3 黑麦草抗冻蛋白的纯化
• 3.4 小结与讨论
• 4 黑麦草抗冻蛋白冰晶结合位点的分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料与试剂
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 黑麦草抗冻蛋白理论三维结构的分析与分析
• 4.3.2 黑麦草抗冻蛋白可能冰晶结合位点分析
• 4.3.3 定点突变引物的设计和突变体载体的构建
• 4.3.4 系列黑麦草抗冻蛋白的突变体的表达和活性检测
• 4.4 结论与讨论
• 5 黑麦草抗冻蛋白基因的烟草转化
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料与试剂
• 5.2.2 实验方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 黑麦草抗冻蛋白基因的植物过量表达载体的构建
• 5.3.2 抗冻基因的烟草遗传转化
• 5.3.3 转基因烟草的鉴定
• 5.4 结论与讨论
• 6 结论与创新
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 6.3 有待进一步研究
• 6.4 研究展望
• 参考文献
• 附录A:测序图
• 致谢
• 附表