论文摘要
研究背景转录因子Sp1通过序列特异性的DNA结合蛋白与靶基因启动子区GC/GT盒结合调控基因表达,在细胞增生、凋亡、分化和肿瘤形成过程中发挥重要作用,是影响肿瘤患者预后的重要因素。Sp1启动子区有包括Sp1在内等多种转录因子的结合位点,可影响Sp1转录活性,但胃癌发生过程中是否发生Sp1启动子区遗传学异常并引起细胞恶性转化还不清楚。同时,研究表明长链非编码RNA（lncRNA）作为编码蛋白的“失能”产物,从遗传、转录和转录后水平调控基因的表达,在恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用。基因组中某些转录位点既可转录编码蛋白的mRNA也转录具有调控作用的lncRNA,而lncRNA往往能够反馈调控同源蛋白编码基因的表达。鉴于Sp1在胃癌发生过程中的重要作用,筛选与Sp1表达相关的lncRNA,围绕Sp1与lncRNA之间的调控作用,探讨两者间相互作用对于胃癌细胞生物学的影响十分必要。研究目的本研究以Sp1启动子为研究对象,在其启动子区检测突变发生情况,以建立突变与Sp1蛋白表达的相关性;通过查找数据库并结合Sp1“过表达”和“干扰”策略,力图在胃癌细胞中筛选出与Sp1表达密切相关的lncRNA,并探讨lncRNA与Sp1之间的反馈调节作用对于胃癌细胞SGC7901增殖作用的影响。首先在101例胃癌患者的病理组织进行抽提dna并进行克隆测序,在12例胃癌病理样本中检测到sp1基因启动子区-684位c→t,-637位t→c和-617位t→g三种类型突变,之后对病理样本进行免疫组化并标化评分,对sp1蛋白表达与突变之间相关性进行分析。之后以pgl-3荧光素酶报告质粒系统为工具,构建分别含有上述3个位点突变启动子的报告质粒,转染293细胞后通过检测荧光素酶活性来反映含有突变位点的启动子活性;接下来通过生物信息学分析上述突变位点是否与转录因子结合序列相关,并对突变位点与患者临床病理特征及预后进行了综合分析以探讨两者间联系。为探讨sp1表达异常的机制,我们通过数据库筛选出与肿瘤相关的lncrna分子,并构建sp1过表达质粒和干扰片段,在胃癌细胞中筛选与sp1表达相关的lncrna;接下来我们设计了针对lncrna基因的小干扰rna,在确认干扰效率的基础上,探讨lncrna对于sp1表达的影响;通过共转染lncrna的rnai和荧光素酶报告质粒,我们初步探讨了lncrna与sp1启动子活性的相关性。最后我们通过cck8、流式细胞术、细胞划痕和transwell等实验分别探讨了sp1和lncrna对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响研究结果我们在12例胃癌病理样本中检测到sp1基因启动子区-684位c→t,-637位t→c和-617位t→g三种类型突变,发生频率分别为3.96%（4例）,5.94%（6例）和1.98%（2例）,通过ihc检测sp1表达,采用fisher精确概率法分析发现sp1蛋白表达与突变之间相关性p>0.05;荧光素酶报告基因实验揭示含有-684位c→t和-617位t→g突变启动子活性增强（p<0.05）,而-637位t→c突变启动子活性与对照组相比未发生明显变化（p=0.319>0.05）,生物信息学分析提示上述三个突变位点并未位于既有/潜在的sp1启动子区的转录因子结合位点;而统计学分析表明突变位点与患者临床病理特征及预后之间没有相关性。通过数据库筛选并结合sp1“过表达”和“干扰”策略,我们发现cdkn2b-as1,h19,kcnq1ot1,mir31hg和xist等5个lncrna与sp1表达呈负相关;而干扰cdkn2b-as1表达后sp1的mrna和蛋白水平均上升;荧光素酶报告实验表明这一干扰研究方法效应能够上调Sp1启动子的活性,且该效应与突变发生与否无关。胃癌细胞生物学研究中,Sp1过表达和干扰CDKN2B-AS1表达能促进胃癌SGC7901细胞的增殖,干扰Sp1表达使凋亡的胃癌细胞数量增加;而干扰CDKN2B-AS1对胃癌细胞凋亡、迁移和侵袭无明显影响。研究结论:1.Sp1基因启动子区检测到的-684位和-617位突变,且能上调Sp1蛋白表达;2.在胃癌细胞株SGC7901中筛选并找到5个与Sp1表达相关的lncRNA分子,其中CDKN2B-AS1对Sp1表达具有下调作用,两者表达呈负相关模式;3.CDKN2B-AS1对Sp1启动子区活性具有负性调控作用,这一作用与上述突变发生与否无关;4.干扰CDKN2B-AS1的表达具有促胃癌细胞SGC7901增殖作用。