论文摘要
正常情况下,人和其他生物能根据自身生长发育的需要合成内分泌激素以调节正常新陈代谢。然而近些年来,人类不断发现一些存在于生物机体之外的具有与人和生物内分泌激素作用类似的物质,有时能引起生物内分泌紊乱,人们称之为环境激素（environmental hormones）,又称为内分泌干扰化学物（endocrine disrupting chemicals, EDCs）。近年来,不断报道野生动物和人类生殖发育异常现象,学者们认为环境雌激素及其他的内分泌干扰物是造成生殖异常的共同原因。有机氯农药滴滴涕（2,2-bis（4-chlorophenyl）-1,1,1-trichloroethane, DDT）和六六六（benzene-hexachloride, BHC, HCB）是污染范围广、危害大、在环境中残留时间长并可通过食物链的生物放大作用而进入机体的持久性有机污染物（persistent organic pollutants, POPs）,可在机体脂肪组织和血脂中存留数十年。p,p’-DDE和β-BHC分别是有机氯农药DDT和BHC的主要代谢产物,在人体和其他动物体内的水平较高。研究表明,这些有机氯农药及其代谢产物多具有生殖内分泌干扰作用,特别是对男性生殖功能的影响已引起人们的高度重视。Fas和FasL是介导细胞凋亡的一对膜蛋白,生精细胞凋亡增多时,Fas和FasL表达明显增强;NF-κB与细胞凋亡的关系密切,其参与多种凋亡相关基因的转录调控,并且发现NF-κB与细胞凋亡存在双向调节关系,它既可抑制细胞凋亡也可促进细胞凋亡;但p,p’-DDE、β-BHC单独及联合作用是否对支持细胞FasL表达和NF-κB活性有影响以及这种影响在p,p’-DDE、β-BHC单独及联合致雄性生殖损害中的意义的研究,国内外鲜有报道。本课题以支持细胞（睾丸曲细精管中唯一的体细胞）作为靶细胞,以p,p’-DDE、β-BHC单独及联合作为受试物来初步探讨进而揭示p,p’-DDE、β-BHC单独及联合作用是否通过激活Fas/FasL系统及其下游NF-κB而对雄性生殖系统造成危害,为p,p’-DDE、β-BHC单独及联合致男性生殖能力下降的机制研究提供一定的科学依据。第一部分:大鼠睾丸支持细胞的离体培养及p,p’-DDE、β-BHC单独及联合作用对支持细胞活力的影响目的:通过探讨p,p’-DDE、β-BHC单独及联合作用对支持细胞活力的影响来确定细胞的作用浓度。方法:对离体培养的支持细胞分别用10μmol/L、30μmol/L、50μmol/L、70μmol/L的p,p’-DDE、β-BHC单独及联合染毒24h后用MTT比色法测定其在490nm的吸光度值。结果:不同浓度p,p’-DDE、β-BHC单独及联合作用于支持细胞24h后,支持细胞的吸光度随着浓度增加而呈下降的趋势。p,p’-DDE、β-BHC单独作用后,其活性改变在50、70μmol/L组有统计学意义（与溶剂对照组比较,P<0.05）,联合染毒后活性改变在50μmol/L时有统计学意义（与溶剂对照组比较,P<0.05）,而其他组别与溶剂对照组比较无统计学意义。结论:吸光度值随着染毒浓度的增加而有逐渐降低的趋势。当p,p’-DDE、β-BHC单独及联合浓度达到50μmol/L时可以看出支持细胞的活性明显降低,与溶剂对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。第二部分:p,p’-DDE、β-BHC单独及联合作用对大鼠睾丸支持细胞FasLmRNA和蛋白表达的影响目的:探讨p,p’-DDE、β-BHC单独及联合作用对支持细胞FasLmRNA和蛋白表达的影响。方法:RT-PCR法研究FasLmRNA表达情况;Western Blot法研究FasL蛋白表达情况。结果:RT-PCR法发现支持细胞内FasLmRNA的表达随p,p’-DDE、β-BHC单独及联合浓度的增加而增强,各高浓度组（50μmol/L）FasLmRNA表达与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）,各组内低（10μmol/L）、中浓度组（30μmol/L）FasLmRNA表达与高浓度组（50μmol/L）比较差异有统计学意义（P<0.05）;Western Blot法发现支持细胞内FasL蛋白的表达随p,p’-DDE、β-BHC单独及联合浓度的增加而增强,各低（10μmol/L）、中（30μmol/L）、高（50μmol/L）浓度组与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。在各高浓度组（50μmol/L）,蛋白表达情况与FasLmRNA的表达相一致。在时间点上FasL在24h内呈现先增高后降低的趋势,在染毒后6h表达量最多。结论:大鼠睾丸支持细胞经p,p’-DDE、β-BHC单独及联合染毒后,FasLmRNA表达明显升高,蛋白表达也呈现增高的趋势;在时间点上,蛋白表达在24h内呈现先增高后降低的趋势。第三部分:p,p’-DDE、β-BHC单独及联合作用对大鼠睾丸支持细胞NF-κB活性的影响目的:探讨p,p’-DDE、β-BHC单独及联合作用对大鼠睾丸支持细胞NF-κB活性的影响。方法:用激光共聚焦显微镜检测NF-κB的转位激活状况。结果:支持细胞细胞核被染成蓝色,NF-κBp65被染成红色,在正常情况下,NF-κB主要存在于胞浆中,不同浓度的p,p’-DDE、β-BHC单独及联合染毒支持细胞24h后,NF-κBp65转移到细胞核中,核转录因子的活性随染毒浓度的增加而增强,各联合染毒浓度组的作用比p,p’-DDE、β-BHC单独作用更加明显。结论:NF-κB的活性随p,p’-DDE、β-BHC单独及联合染毒浓度的增加而增强,且联合作用比单独作用更加明显。综上所述,本研究结果表明:1. p,p’-DDE、β-BHC单独及联合对支持细胞的最大染毒浓度为50μmol/L;2.大鼠睾丸支持细胞在p,p’-DDE、β-BHC单独及联合作用24h后,FasLmRNA的表达随着染毒浓度的增加而表达增强;3. FasL蛋白表达随着染毒浓度的增加而增强,在24h内呈现先增高后降低的趋势;4. NF-κB随染毒浓度的增加而活性逐渐增强,呈剂量依赖性关系。这些研究表明p,p’-DDE、β-BHC单独及联合作用可引起睾丸支持细胞FasLmRNA水平的升高,进而导致FasL蛋白表达的升高,激活Fas/FasL系统,而NF-κB可能通过调控FasL的表达,进而通过调节睾丸生殖细胞的凋亡而影响正常精子发生。研究还发现联合染毒组NF-κB的活性比单独作用时更加明显,因此可推测p,p’-DDE、β-BHC的联合对离体大鼠睾丸支持细胞的影响有交互作用,但p,p’-DDE、β-BHC单独及联合作用对FasL和NF-κB下游Caspase的影响及其对支持细胞凋亡的影响,还有待于深入研究。