论文摘要
肠道病毒71型EV71、柯萨奇病毒等肠道病毒引起的手足口病是一种常见的病毒性传染病,其中EV71引起的手足口病发生重症比例较大,致死率高,所引起的神经系统并发症可导致死亡或永久性肌麻痹,严重威胁儿童健康。手足口病是全球性传染病,世界大部分地区均有此病流行的报道。我国自1981年在上海发现本病,以后北京、河北等十几个省市均有报道。从近年报告的疫情资料来看,手足口病在中国呈蔓延上升趋势。手足口病临床上目前尚无特效药物,也没有疫苗等特异性治疗方法。研制具有抗病毒谱广、活性强的抗手足口病药物,保障我国婴幼儿的健康成长乃至社会经济的健康发展有着重要的社会意义。本文旨在以EV71的3C蛋白酶为靶点建立抗病毒药物筛选模型,主要建立了酵母逆向双杂交模型和体外模型,具有原始创新性。本研究建立了3C蛋白酶逆向酵母双杂交模型,利用PCR方法直接克隆获得3C蛋白酶基因、GAL4转录因子DNA结合结构域和转录激活结构域以及筛选标记基因URA3等基因片段,采用常规分子生物学手段进行表达载体构建,LiAc法转化酵母细胞,利用营养缺陷型筛选标记筛选得到酵母模型菌株,采用固体培养的方法进行药物的筛选,并且利用α-半乳糖苷酶活性在细胞水平建立药物活性的定量评价方法。本研究利用酵母细胞模型菌株固体培养的方法筛选了46种中成药,筛选得到了18种具有抑制活性的中药。选取活性较高的04口服液进行下一步实验,采用常规药物化学分离技术手段对04口服液进行分离提取,提取后的组分药再利用酵母模型固体培养方法筛选活性成分。首先利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取分离,筛选结果表明乙酸乙酯和正丁醇部位有效。硅胶柱层析继续分离乙酸乙酯部分,活性跟踪结果表明活性组分分布在在第49至52组分；正丁醇部分利用反向C18柱进行分离,结果活性组分集中在5%,10%,15%甲醇洗脱部分,进一步从5%甲醇洗脱部分分离得到一单体分子,NMR、LC-MS等色谱技术结构鉴定确定其结构,此物质是否阳性药物有待进一步探讨。体外模型主要利用大肠杆菌表达系统表达EV71的3C蛋白酶。把3C蛋白酶基因亚克隆到表达载体pET21b,转化大肠杆菌细胞,低温诱导表达,镍柱亲和层析纯化获得高纯度的3C蛋白酶；合成制备自身具有荧光发射和荧光淬灭的多肽底物,建立体外的酶促反应体系和药物筛选体系,进行体外药物活性评价。本研究已经利用大肠杆菌进行了3C蛋白酶的表达纯化,对其蛋白酶活性进行了定性分析,上述工作为筛选活性药物分子奠定了基础。总之上述研究为研发抗手足口病的新药奠定了坚实的基础。另外,小RNA病毒的3C蛋白酶在序列和空间构象上具有一定的同源性,对3C蛋白酶活性的研究和探索有助于了解和研究3C蛋白酶,进而为治疗肠道病毒属等引起的疾病提供了科学依据和理论基础。