论文摘要
糖尿病（diabetes mellitus,DM）是一种常见的内分泌代谢疾病,晚期的各种大小血管并发症是其主要的死亡原因。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）最为常见,属于一种复杂病（多基因-多因子病）。T2DM的发生由胰岛β细胞功能失调和胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）共同引起,其自然病程包含了一段较长时间的“前驱糖尿病期”,即糖调节受损期（impaired glucose regulation,IGR）,包含空腹血糖受损（impaired fasting glucose,IFG）和糖耐量受损（impaired glucose tolerance,IGT）两种状态。大量流行病学研究已经表明,IFG和IGT均是DM和心血管疾病的危险因子和危险标志。随着现代人类劳动强度显著下降、不健康的饮食习惯和应激状态的增多,DM的发病率迅速上升并有年轻化的趋势;同时存在IFG/IGT的隐匿性流行。目前DM治疗方案虽然能够有效控制高血糖,但长期使用均会有明显的副反应,结合DM的发病机制探索新的治疗靶点显得极为必要。虽然DM的发病机制尚未完全阐明,但已有大量动物实验和人群试验的证据表明氧化应激是DM及其并发症的重要发病机制,同时某些抗氧化剂的应用能够降低DM患者和动物体内的氧化应激和脂质过氧化,但结论不太一致,提示个体存在氧化应激易感性差异,其清除氧化剂的能力可能直接决定了其罹患T2DM易感性的高低。因此,深入研究影响人类对氧化应激易感性的遗传因素对于开发更好更有效的T2DM治疗方法是很有必要的。在众多候选基因之中,血红素氧化酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）因具有较强的抗炎、抗氧化和抗增生作用,与多种氧化应激相关性疾病的发生密切相关,而且可被多种膳食中的抗氧化剂诱导,引起了人们的重视。关于HO-1与DM关系的研究目前主要集中于体外试验,DM动物模型体内HO-1的作用研究较少,且结果不太一致;而关于HO-1是否对DM病人具有同样效应的流行病学研究刚刚开展,值得进一步探讨。此外,疾病关联的遗传研究发现,遗传可变性能够影响HO-1对外源性应激的反应,个体处于应激时HO-1反应有很大差异。已有研究报道HO-1基因启动子区域有两处潜在的功能性多态性位点:（GT）n微卫星多态性和T（-413）A SNP位点,对应激因素诱导的HO-1反应具有调节作用。因此,深入研究个体的HO-1基因型与T2DM发生的关联可以为其临床应用的可行性提供理论指导。因此,本研究拟从动物试验和流行病学研究角度开展,分别探讨某天然抗氧化剂对DM小鼠肾脏氧化应激通路的作用及HO-1介导的机制研究,以及HO-1启动子基因多态性与T2DM易感性的关联研究。第一部分:动物试验（天然抗氧化剂对DM小鼠肾脏氧化应激通路的作用及HO-1介导的机制研究）目的:观察不同病程的DM（4 w和8 w）小鼠肾脏氧化应激和HO-1系统的动态变化,探讨HO-1在（diabetic nephropathy,DN）发展进程中的作用;同时,观察某天然抗氧化剂（MG）的保护作用机制,对HO-1在抗氧化剂筛选中的作用进一步阐明。方法:雄性Balb/c小鼠采用四氧嘧啶诱导DM模型。正常小鼠及DM小鼠分别按治疗方式的不同进一步分为3个亚组:对照组:生理盐水灌胃;低剂量MG组:150 mg/kg MG灌胃;高剂量MG组:300 mg/kg MG灌胃。灌胃4 w、8 w后分别检测血糖、果糖胺、脂类和肾功能指标;肾脏线粒体氧化损伤和抗氧化系统指标:丙二醛（malondialdehyde, MDA）、谷胱甘肽（glutathione, GSH）、锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase, Mn-SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）以及肾脏微粒体HO-1活性;肾脏HO-1和Mn-SOD mRNA的表达水平;并进行肾脏病理学检查。结果:（1）MG对DM小鼠一般状况的影响:四氧嘧啶造模后,DM小鼠出现明显的多饮、多食、多尿和体重下降现象。低、高剂量MG尤其是低剂量MG,从第3 w开始能显著改善DM小鼠的多饮现象。实验结束时,低剂量MG治疗组DM小鼠体重虽未恢复至正常水平,但已较DM组显著升高。（2）MG对DM小鼠血糖、果糖胺和血脂的影响:四氧嘧啶造模后4 w和8 w,小鼠血糖和果糖胺均较正常组显著升高,且两者显著正相关;低、高剂量MG均能显著降低血糖,但未恢复至正常水平。实验8 w时,DM小鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平较正常组也显著升高;低、高剂量MG能显著降低DM小鼠血清总胆固醇含量。（3）MG对DM小鼠肾脏结构和功能的影响:DM小鼠在实验8 w时出现明显的DN早期病理改变,同时肾功能出现异常:尿素氮和肌酐含量明显高于正常组;低剂量MG治疗能显著降低肌酐含量。（4）MG对DM小鼠肾脏线粒体氧化损伤和抗氧化系统的影响:实验4 w时,DM小鼠肾脏线粒体MDA含量较正常组显著升高,GSH含量则显著降低;抗氧化酶Mn-SOD和GSH-Px活性较正常组均明显升高,CAT活性则降低;低剂量MG能使Mn-SOD、GSH-Px活性恢复至正常水平。8 w时DM小鼠肾脏线粒体MDA含量和GSH含量仍较正常组分别显著升高和降低;抗氧化酶Mn-SOD、CAT活性较正常组明显降低;低、高剂量MG治疗能显著降低线粒体MDA含量,同时低剂量MG可在一定程度上升高Mn-SOD活性,但尚无显著性差异。（5）MG对DM小鼠肾脏微粒体HO-1活性的影响:四氧嘧啶造模后4 w,DM小鼠肾微粒体HO-1活性显著升高;低、高剂量MG治疗后,DM小鼠肾微粒体HO-1活性明显降低,与正常组无差异。8 w时DM组小鼠肾微粒体HO-1活性显著降低;低剂量MG治疗后,DM小鼠肾微粒体HO-1活性明显升高,与正常组无差异。（6）MG对DM实验小鼠肾脏HO-1和Mn-SOD mRNA表达水平的影响:实验4 w时,DM组小鼠肾脏HO-1、Mn-SOD mRNA水平较正常组均显著升高;低剂量MG能显著降低DM小鼠肾脏HO-1、Mn-SOD mRNA的表达水平。实验8 w时,DM组小鼠肾脏HO-1、Mn-SOD mRNA水平均显著低于正常组。低、高剂量MG能显著升高DM小鼠肾脏HO-1 mRNA的表达水平。此外,低剂量MG也能显著升高DM小鼠肾脏Mn-SOD mRNA的表达水平。结论:（1）氧化应激通过影响（诱导或抑制）抗氧化应激蛋白HO-1系统参与DM和DN的发生发展过程。（2）HO-1在DM发展的不同时期分别具有促氧化和抗氧化的双重作用,并因此参与线粒体某些抗氧化酶基因的调节。（3）MG可以减轻肾脏的氧化应激,在一定程度上阻止DN的发展。其抗氧化作用的发挥由HO-1介导。第二部分分子流行病调查研究（HO-1启动子基因多态性与T2DM易感性的关联研究）第一节氧化应激在T2DM发生发展进程中的作用目的:以不同糖代谢状态人群（正常糖耐量个体[normal glucose tolerance,NGT]、IGR[IFG和/或IGT]以及新诊断的T2DM病人）为研究对象进行较大样本量的流行病学研究,描述IGR和新诊断T2DM人群流行病学特点;探讨氧化应激与胰腺β细胞功能失调和IR的关系;阐明氧化应激在T2DM发生过程中的作用,为T2DM前期病人预防T2DM的发生提供重要的理论依据。方法:研究对象为2004年12月-2007年11月在华中科技大学同济医院内科内分泌实验室做口服糖耐量试验（oral glucose tolerance test,OGTT）的门诊病人和体检中心年龄和性别匹配的正常个体,将所有研究对象按照美国糖尿病学会（American diabetes association,ADA）糖尿病诊断标准和OGTT结果分为3组:NGT组（1615例）、IGR组（371例）和新诊断T2DM组（1103例）。对个体进行问卷调查,分析NGT、IGR和T2DM人群人口学资料、行为和饮食习惯及家族史的差异;用稳态模式评估法（homeostasis model assessment,HOMA）评价IR和β细胞分泌功能;检测不同糖代谢状态人群的氧化应激（MDA含量）与抗氧化状态（GSH含量、SOD活性以及总抗氧化能力[total antioxidant capacity,TAC]）;采用彗星试验评价DNA氧化损伤;并分析上述指标与IR和β细胞分泌功能的相关性。结果:（1）研究人群的一般情况:与NGT人群相比,IGR和DM病人具有高DM风险因素:BMI明显增高,已到达肥胖标准;高血压、饮酒和DM家族史的频率也显著增高。而吸烟、膳食习惯和体力活动在各组内分布比例相似（P>0.05）。（2）生化指标:从NGT→IGR→DM,空腹血糖（fasting plasma glucose,FPG）、HOMA-IR不断升高,而HOMA -βcell不断降低,各组之间均有显著性差异（P<0.05）;IGR和DM病人空腹血浆胰岛素（fasting plasma insulin,FPI）、甘油三酯和总胆固醇均较NGT组明显升高;与NGT和IGR组相比,DM组糖化血红蛋白（HbA1c）水平也显著升高。（3）氧化应激和抗氧化状态:与NGT和IGR组相比,DM病人血浆MDA含量显著升高,而血浆TAC水平则显著降低;IGR和DM病人红细胞GSH含量均在正常范围内,而SOD活性较NGT人群均显著降低。相关分析表明HOMA-IR与BMI值和血浆MDA含量显著正相关,而与血浆TAC水平和红细胞SOD活性明显负相关;相反,HOMA-βcell值与血浆TAC水平呈明显正相关关系,而与红细胞GSH含量负相关。（4）DNA氧化损伤:对27例NGT个体、16例IGR和34例T2DM病人的彗星试验分析表明:从NGT→IGR→DM,尾部DNA含量（% Tail DNA）和Olive尾距（Olive Tail Moment,OTM）逐渐升高,且各组之间均有显著性差异。相关分析表明,% Tail DNA与BMI、FPG、HOMA-IR正相关,与HOMA-βcell分泌指数负相关;OTM与FPG、HOMA-IR正相关,与HOMA-βcell分泌指数负相关。结论:本次研究通过大样本的病例对照研究调查糖尿病前期病人（IGR）和新诊断T2DM病人体内氧化应激通路和DNA氧化损伤状态,初步勾勒出T2DM发生的可能机制:即使在IGR状态,轻度增高的空腹血糖或者餐后2h血糖也会导致氧化应激增强或者抗氧化系统受损或者两者皆有,随后导致氧化性DNA损伤。而氧化性DNA损伤又引起胰腺β细胞功能紊乱,IR以及更为显著的高血糖,这个恶性循环最终导致DM的发生。第二节HO-1启动子基因多态性与T2DM易感性的关联研究目的:以上述第一节中不同糖代谢状态人群（NGT、IGR和新诊断的T2DM病人）为研究对象,初步评价个体HO-1的表达水平与不同糖代谢状态的关系;进一步探讨HO-1启动子区域两处基因多态性:（GT）n和T（-413）A SNP与IGR和T2DM发病的相关性,并对其功能相关性进行初步探讨。方法:采用流式细胞仪检测个体外周血单核细胞（peripheral blood monouclear cells,PBMCs）HO-1表达水平;提取外周血细胞DNA,通过遗传分析仪对（GT）n微卫星多态性进行片断分析,采用TaqMan探针法进行T（-413）A SNP基因分型;对两处多态性位点进行连锁分析（连锁不平衡分析软件[linkage disequilibrium analysis,LDA]）并构建单体型（PHASE2.0软件）;校正T2DM高危因素,分别评价这两处多态性位点以及单体型与IGR和T2DM发生的关联;结合HO-1表达水平探讨两处多态性位点的功能相关性。结果:（1）PBMCs HO-1表达水平:IGR和T2DM病人PBMCs HO-1表达水平较NGT组均明显降低,P值均小于0.05。（2）（GT）n微卫星多态性与T2DM发生的关联研究:所有研究人群中（GT）n重复次数从12到40次不等,在所有研究对象及各组内均呈双峰分布,22次和30次频率最高,是主要的等位基因片段;参照（GT）n微卫星多态性等位基因的频率分布情况以及HO-1疾病关联研究和体外功能试验的研究结果,将（GT）n重复次数进一步分为两类亚型:短重复片段（S）为<25 （GT）n,长重复片段（L）为≥25 （GT）n;与NGT组相比,IGR和T2DM组L等位基因以及L/L基因型频率明显增高;校正经典T2DM危险因素后的回归分析显示:与S/S基因型相比,L/L基因型发生IGR的危险性明显增高（OR,1.739;95% CI,1.026-2.949;P=0.040）,含有L等位基因的基因型（S/L和L/L基因型）是T2DM发病的独立危险因素,S/L和L/L基因型发生T2DM的危险性分别是S/S基因型的1.446倍（95% CI,1.051-1.990;P=0.023）和1.621倍（95% CI,1.113-2.362;P=0.012）;将IGR与T2DM组合并分析后,也取得了类似的结果,S/L和L/L基因型的校正OR值分别为1.352（95% CI,0.998-1.831;P=0.048）和1.651（95% CI,1.156-2.358;P=0.006）。（3）T（-413）A SNP与T2DM发生的关联研究:不同糖代谢状态人群T（-413）ASNP位点各等位基因和各基因型的分布无显著性差异;校正经典T2DM危险因素后的回归分析显示,T/A及A/A基因型携带者相对T/T基因型携带者发生IGR、T2DM以及IGR合并T2DM的危险性未见显著性差异。（4）连锁不平衡分析及单体型构建:LDA分析显示（GT）n微卫星多态性与T（-413）A SNP位点的D′值为0.72,表示两位点存在较强的连锁程度;利用PHASE 2.0软件共构建了4种单体型:TS、TL、AS和AL,其中TS和AL是两类最主要的单体型;校正其他T2DM发病的危险因素后,与最主要的单体型TS相比,单体型TL与IGR和T2DM发病密切相关,OR值分别为1.816（95% CI,1.179-2.796;P=0.007）和1.487（95% CI,1.091-2.027;P=0.012）。IGR和T2DM联合分析时也得到了类似的结果,TL单体型携带者患IGR和T2DM的风险性较TS单体型明显增高,OR值为1.555（95% CI,1.158-2.089;P= 0.003）。（5）功能学评价:校正已知T2DM危险因素后,三组不同糖代谢状态人群PBMCs HO-1的表达水平随（GT）n-L等位基因数目的增多而降低,L/L纯合子携带者PBMCs HO-1表达水平最低;此趋势在IGR组与T2DM组均具有显著性差异,与S/S基因型携带者相比,L/L基因型HO-1表达水平显著降低。T（-413）A SNP位点不同基因型对不同糖代谢人群PBMCs HO-1的表达水平均无显著影响。进一步的单体型对与PBMCs HO-1表达水平的相关性分析表明:在A/A基因型亚组中,S-等位基因携带者（单体型对为AS/AS）的HO-1表达水平明显高于L-等位基因携带者（单体型对为AL/AL）,NGT组和T2DM组均可观察到这一差异;在T/T基因型亚组中,T2DM病人中单体型TS/TS携带者HO-1表达水平明显高于单体型TL/TL携带者。结论:（1）（GT）n微卫星多态性位点通过调节个体HO-1表达水平与IGR和T2DM的发生相关联:长（GT）n片段（L,≥25次）携带者HO-1表达水平降低,其罹患IGR和T2DM的风险性增加。（2）（GT）n微卫星多态性与T（-413）A SNP位点相互连锁,单体型TL与高IGR和T2DM风险相关。（3）（GT）n微卫星多态性位点在调节HO-1功能方面起主导作用。（4）（GT）n微卫星多态性可以作为T2DM的新型遗传标记,对IGR和T2DM的临床防治具有重要的指导意义
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