银杏组织、细胞培养及其生产黄酮的代谢调控研究

论文题目: 银杏组织、细胞培养及其生产黄酮的代谢调控研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 森林培育学

作者: 陈颖

导师: 曹福亮

关键词: 银杏,组织培养,细胞培养,诱导子,黄酮,代谢调控

文献来源: 南京林业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 银杏(Ginkgo biloba L.)是原产我国古老的孑遗植物,集药用、食用、观赏、材用于一体,特别是银杏叶中存在两类重要的生理活性物质——黄酮类化合物(flavonoids)和萜内酯(银杏内酯ginkgolides),这两种物质均为银杏所特有。为早日实现细胞培养生产两类活性物质的工业化,我们以银杏的成熟胚培养的无菌幼苗和实生苗的雌雄植株幼茎为原始材料,对银杏的组织培养技术进行了研究;并利用无菌苗的幼叶和雌雄株的叶片建立了愈伤组织和悬浮培养体系,进而利用稀土和水杨酸两种诱导子对银杏黄酮的生产进行代谢调控,初步研究了两种诱导子的作用机制,为银杏细胞培养大量合成次生代谢物提供技术平台。主要研究结果如下: 1.对5 个不同优良银杏品种成熟胚培养的条件了筛选,发现品种之间差异不大,3种培养基中DCR 培养基最适宜于成熟胚的培养。 2 . 对不同外植体进行器官分化研究, 发现10d 龄的子叶在MS+NAA0.2mg/L+BA0.5mg/L 和MS+NAA0.2mg/L+KT0.5~1.0mg/L上培养有不定根的发生;在MS+NAA1.0 mg/L　+KT2.0 mg/L　培养基上诱导出了子叶的2 个不定芽,频率只有5%左右。另外在幼叶,未成熟的雄花粉也有不定根的发发生。　 3.以银杏幼苗茎段为外植体进行快繁研究发现,各段存在位置效应,顶芽段(上段)一般只长高,展叶;而中段先诱导出腋芽或不定芽,再长高;而下段一般诱导出2~3 个子叶腋芽或产生不定芽。　通过添加生长调节剂对幼苗的顶芽、中段、下段分别培养,发现最适宜的培养基为N6 和改良MS,适宜激素配比为NAA0.1~0.5　mg/L,6-BA0.5~1.0mg/L。生长调节剂可以诱导多个叶片的产生,继代后,叶片数,叶面积远大于对照。　稀土处理后对顶芽的高度无显著差异,但能促进腋芽诱导率和叶片的面积,为细胞培养生产次生代谢物提供原料基础。　对一个月龄无菌苗的各部位进行激素测定,发现顶芽中主要含生长素,在中段、下段和子叶含有分裂素,叶片中含有的激素较低,这些结果可以为银杏的组培快繁中激素调控提供基础。　 4.银杏的芽苗生根在附加在1/2MS+0.5mg/L IBA 的条件下,最高生根率44 号品种,只有33.3%,而附加稀土后各品种的生根率在0.5~5mg/L 范围内生根率大大的提高,其中79 号品种在1mg/L 的稀土条件下生根率达66.7%,提高了40 个百分点,效果极显著,而且生根比对照提前7 天,生根数也远多于对照。而高浓度10~20mg/L 抑制不定根的发生。　 5. 通过筛选银杏愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+NAA1.0 mg/L +BA0.5 mg/L,继代培养基为MS+NAA1.0 mg/L +KT0.5 mg/L;叶片、子叶、根诱导的愈伤组织中黄酮含量高。

论文目录:

第一篇文献综述

第一章银杏组织及细胞培养研究进展

1 银杏组培快繁研究进展

1.1 银杏器官发生与植株再生

1.2 银杏体细胞胚发生及植株再生

1.3 银杏细胞培养产生药物的研究进展

第二章稀土和水杨酸在组织及细胞培养上的应用研究进展

1 稀土元素在组织及细胞培养上的研究进展

1.1 稀土在组织快繁上的应用

1.2 稀土对愈伤组织诱导、生长及细胞生长的影响

1.3 稀土对体细胞胚发生的影响

1.4 稀土对次生代谢物合成和释放的影响

1.5 稀土在组织及细胞培养中可能的作用机理

1.6 问题与展望

2 水杨酸在植物细胞培养上的应用

3 研究的目的和意义

3.1 银杏组培快繁中存在的问题

3.2 银杏组织及细胞培养生产次生代谢物存在的问题

3.3 研究的主要内容

3.4 研究的技术路线

第二篇银杏无菌培养体系的建立

第三章五个银杏品种成熟胚离体繁殖培养基的选择研究

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 材料处理

1.3 培养基

1.4 培养条件

2 结果与分析

2.1 不同银杏品种种胚萌发状况的比较

2.2 5个银杏品种胚根生长的比较

2.3 5个银杏品种苗高生长的比较

3 结论与讨论

3.1 培养基选择的结果及品种的优良度排序

3.2 不同培养基对银杏成熟胚离体培养的影响

第四章银杏外植体器官分化及子叶愈伤组织细胞学观察

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

1.2 培养基配制与灭菌

1.3 石蜡切片制作

2 结果与分析

2.1 不同调节剂对子叶愈伤组织诱导及器官分化的影响

2.2 子叶及其愈伤组织的细胞学观察

2.3 不同调节剂水平对根段愈伤组织诱导及器官分化的影响

2.4 不同调节剂水平对叶片器官分化的影响

2.5 雄花粉培养的器官发生现象

3 讨论

第五章银杏茎段的组织培养研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 培养基

1.3 银杏雌、雄株茎段的离体培养

1.4 培养基的灭菌

1.5 培养条件

1.6 茎段高度和叶面积的测定

1.7 石蜡切片制作

1.8 激素含量的测定

2 结果与分析

2.1 顶芽的培养

2.2 中段和下段腋芽及不定芽的诱导

2.3 顶芽叶片生长状况

2.4 银杏雌、雄株茎段的离体培养

2.5 5个品种各段内源激素的比较

3 讨论

4 结论

第六章稀土对银杏芽苗不定根发生的影响及不定根细胞学观察

1 材料和方法

1.1 外植体来源

1.2 生根培养基

2 结果与分析

2.1 不同浓度稀土对5 个品种银杏芽苗生根的影响

2.2 不定根再生过程中根发生的细胞学观察

3 结论与讨论

3.1 稀土对银杏芽苗不定根的影响

3.2 银杏不定根根原始体的类型及组织学起源

第三篇　组织、细胞培养生产银杏黄酮的代谢调控研究

第七章稀土对银杏愈伤组织黄酮合成代谢的影响研究

1 材料与方法

1.1 外植体的来源

1.2 愈伤组织生长实验参数的测定

1.3 生理生化指标的测定

2 结果与分析

2.1 不同品种幼苗叶片愈伤组织诱导率的比较

2.2 不同外植体诱导率及愈伤组织继代后生长的状态比较

2.3 不同品种、不同器官继代6 次后愈伤组织黄酮含量的比较

2.4 不同稀土对愈伤组织生长的影响

2.5 不同稀土浓度对银杏愈伤组织细胞生活力的影响

2.6 不同稀土处理对银杏愈伤组织核酸含量的影响

2.7 稀土处理对银杏愈伤组织蛋白质含量的影响

2.8 稀土处理对银杏愈伤组织过氧化物酶活性的影响

2.9 稀土处理对银杏愈伤组织苯丙氨酸解氨酶活性的影响

2.10 稀土处理对银杏愈伤组织多胺含量的影响

2.11 稀土处理对银杏愈伤组织黄酮含量的影响

2.12 各指标与总黄酮间的相关分析

3 结论与讨论

3.1 稀土对愈伤组织生长、核酸、蛋白质含量、细胞活力的影响

3.2 稀土对POD 、PAL 酶活性的影响

3.3 稀土对多胺活性的影响

3.4 稀土对黄酮合成的影响

3.5 稀土浓度与细胞代谢的关系

第八章水杨酸对银杏愈伤组织细胞生长和次生代谢的影响

1 材料和方法

1.1 外植体的来源

1.2 材料的消毒、接种与培养

1.3 愈伤组织的诱导及继代培养

1.4 愈伤组织生长实验参数的测定

1.5 生理生化指标的测定

2 结果与分析

2.1 水杨酸对银杏愈伤组织细胞生长的影响

2.2 水杨酸对银杏愈伤组织细胞活力的影响

2.3 SA 对银杏愈伤组织核酸和蛋白质含量的影响

2.4 SA 对银杏愈伤组织POD 和CAT 活性的影响

2.5 水杨酸对银杏愈伤组织PAL 酶活性的影响

2.6 水杨酸对银杏愈伤组织多胺含量的影响

2.7 水杨酸对银杏愈伤组织黄酮含量的影响

2.8 各指标之间的相关性分析

3 结论与讨论

第九章稀土、水杨酸对悬浮培养细胞黄酮含量的影响

1 材料与方法

1.1 愈伤组织的来源

1.2 悬浮培养体系的建立

1.3 诱导子的添加

1.4 细胞悬浮培养实验参数的测定

1.5 黄酮含量的测定

2 结果与分析

2.1 不同条件下悬浮培养细胞类黄酮含量的比较

2.2 稀土对悬浮细胞相对生长速率的影响

2.3 稀土对悬浮细胞总类黄酮含量的影响

2.4 稀土和水杨酸处理对银杏悬浮细胞黄酮甙成分的影响

3 结论与讨论

第十章不同状态银杏愈伤组织蛋白质电泳分析及电镜观察

1 材料与方法

1.1 愈伤组织的诱导与培养

1.2 愈伤组织细胞超薄切片制备和透射电镜观察

1.3 愈伤组织可溶性蛋白质含量及SDS-PAGE 电泳分析

1.4 类黄酮含量的测定

2 结果与分析

2.1 三种银杏愈伤组织可溶性蛋白质含量及类黄酮含量的比较

2.2 蛋白质SDS-PAGE 电泳分析

2.3 三种状态愈伤组织超微结构的观察

3 结论与讨论

结语

参考文献

详细摘要

发布时间: 2005-12-30

参考文献

[1].银杏药效次生物生物合成及其栽培措施调控[D]. 冷平生.北京林业大学2005
[2].银杏种质资源遗传多样性的AFLP研究[D]. 王利.山东农业大学2006
[3].银杏古树半同胞家系变异规律及株高生长基因筛选[D]. 唐海霞.山东农业大学2016

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