论文题目: 五个突变位点对大片段Taq DNA聚合酶聚合功能影响的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物遗传育种
作者: 程玉鹏
导师: 王同昌,李文滨
关键词: 聚合酶,定点回复突变,蛋白表达系统,蛋白纯化,加热纯化蛋白
文献来源: 东北农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: Taq DNA聚合酶是1976年从嗜热菌Thermus aquaticus中分离的耐热聚合酶。约10年后,随着PCR(polymerase chain reaction)技术的发明与应用,Taq DNA聚合酶成了家喻户晓的分子生物学的工具。Taq DNA聚合酶结构上属于Ⅰ型DNA聚合酶(DNA polymerase Ⅰ)或A族DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶的聚合酶区与所有的DNA聚合酶都有相同的结构特征,其形状就像人的右手一样,由拇指区,掌心区和手指区组成。掌心区的功能是催化磷酰基转移反应,手指区的功能则是促进三磷酸核苷酸与模板配对。拇指区控制双链DNA的位置移动和子链延伸。TaqDNA聚合酶与其他A族DNA聚合酶一样具有N端的5’核酸外切酶区,位于C端聚合区与N端5’核酸外切酶区之间的3’核酸外切酶区。但由于Taq DNA聚合酶的3’核酸外切酶区结构上的变化和多位点氨基酸替换而丧火了3’-5’的外切校正功能,只保留了5’核酸外切酶功能。因此,Taq DNA聚合酶在聚合过程中有错误延伸倾向。去掉了N端5’-3’核酸外切酶区的大片段Taq酶(Large Fragment of Thermus aquaticus polymerase Ⅰ),恢复了3’-5’的外切酶活性,复制的准确率是Taq全酶的2倍。在应用方面,大片段Taq酶的耐热性提高,因而更适宜扩增GC含量高和含有二级结构的模板,其变性温度可达到98℃。这种耐热性和较弱的3’-5’外切功能使其具备了长链扩增的能力,可扩增35kb以上的模板。 为了研究决定酶活性的特殊位点以改善突变酶的聚合功能,对无活性的大片段Taq DNA聚合酶-LFTM5进行回复突变和蛋白表达的研究。 研究的材料LFTM5,长度为1682bp,表达蛋白约62kDa,最初被克隆在pPCR-Script质粒上,由于在构建载体时,pPCR-Script上Lac启动子区被破坏,故该载体不能在E coli DH5 α中表达。在重新选择表达载体的同时,测序载体兼突变载体也重新选择。测序兼突变载体为pliv-SelectⅡ,该载体大小为2.8 kb,多克隆位点含有HpaⅠ平端限制酶酶切位点,适合由pfu PCR扩增的平末端产物连接。多克隆位点两侧有通用测序引物,测序方便。pliv-SelectⅡ/LFTM5全长4.4 kb为理想的突变模板。测序利用LI-COR 4200 DNA测序系统进行,并使用相关软件进行序列分析。经与野生型Taq DNA聚合酶相同区域比较后发现无活性的大片段聚合酶LFTM5共有五个突变点:K230N、A383T、F389Y、R399H、F491L。由于这5个突变位点的存在导致了LFTM5的聚合活性丧失。为了进一步研究个突变位点的功能,利用回复突变创造了29个回复突变子。对有聚合酶活性的同复突变子进行分析发现:Y389F的出现频率为100%,说明F389为酶活性的关键位点。N230K和H399R在有活性突变子中出现的频率相同都为66%,T383A和L491LF的出现频率相同都为50%,说明K230与R399对酶活性的影响力要高于A383和F491。通过在结构上与其它DNA聚合酶功能位点比较发现,F389位于手指区0-螺旋区,属于保守位点,是聚合酶结构闭合催化反应必需的位点,该位点突变导致酶对盐分敏感,因此,该位点的功能是稳定聚合前体-“酶-DNA-核苷酸”三元复合物。F389突变破坏了三元复合物的结构稳定性,导致聚合反应无法完成。K230位于拇指区的H1和H2螺旋之间,属于相对保守位点,是开放结构和
论文目录:
中文摘要
英文摘要
1 前言
1.1 Taq DNA聚合酶结构和功能的研究进展
1.1.1 Taq DNA聚合酶的结构和作用机制
1.1.2 Taq DNA聚合酶性能的改进的研究进展
1.2 大片段DNA聚合酶的研究进展
1.3 Taq DNA聚合酶在遗传育种方面的研究进展
1.3.1 随机扩增多态性DNA技术(RAPD)
1.3.2 已标记序列扩增带技术(SCAR)
1.3.3 扩增片段长度多态性技术(AFLP)
1.3.4 简单序列重复技术(SSR)
1.4 本研究的目的和意义
1.4.1 选题背景和目的
1.4.2 研究的意义
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 携带大片段Taq DNA聚合酶的质粒
2.1.2 菌株和质粒
2.1.3 酶
2.1.4 主要反应试剂和试剂盒
2.1.5 实验仪器和分析软件
2.2 方法
2.2.1 克隆载体的构建
2.2.2 基因突变
2.2.3 LFTM5回复突变子的蛋白表达
3 结果与分析
3.1 LFTM5的DNA和氨基酸序列
3.2 基因回复突变
3.3 蛋白表达
3.4 突变子的聚合功能测定
3.5 酶蛋白活性测定
4 讨论
4.1 基因突变
4.2 蛋白表达与纯化
4.3 各突变位点对酶活性的影响评价
4.3.1 K230N，A383T，R399H和F492L对酶活性的影响
4.3.2 F389Y对酶活性的影响
4.3.3 不同突变位点对复制忠实性的影响
4.4 酶蛋白纯度和浓度对PCR的影响
4.4.1 蛋白纯度对酶活性的影响
4.4.2 酶蛋白纯度和浓度对PCR的影响
5 结论
5.1 LFTM5具有聚合酶的结构特征但无聚合酶活性
5.2 各突变位点对酶的聚合活性具有的不同影响力
5.3 F389为聚合酶结构上关键功能位点
5.4 酶蛋白的纯度和浓度对PCR的影响
5.5酶蛋白的纯度和浓度对pcR的影响
参考文献
附录
致谢
个人简历
发布时间: 2005-10-31
参考文献
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