苹果microRNA的检测鉴定及前体结构预测

论文摘要

microRNA （miRNA）是一类来自真核生物自身基因组的非编码小分子RNA,它作为一种真核生物体内的重要的调节因子,在生物体内发挥着重要的调控作用,并影响着生物体生命活动的各个方面。研究表明,miRNA在植物的生长发育过程中也扮演着重要角色,它对植物的发育、开花时序、新陈代谢、应激反应等许多方面起着重要的调控作用。miRNA调节基因的方式是生物领域中的一个重大发现,向人们展示了一种新的基因调节模式。本研究以‘寒富’苹果为试材,系统地研究了苹果植株中miRNA的种类,分析了其保守性特点,建立了苹果中miRNA的茎环RT-PCR检测体系,在此基础上,研究了miRNA在苹果离体试管苗与田间苗之间的表达差异,并利用EST数据库信息和生物信息学软件预测了苹果中相关miRNA的前体结构,探索了miRNA在苹果植株生长发育过程中的可能作用,主要结果如下：1.采用miRNA基因芯片,从苹果植株中检测到154个miRNA,有67个miRNA的荧光信号强度介于400和1500之间,87个miRNA荧光信号强度超过1500,其中来自：miRNA数据库的100个miRNA属于35个miRNA家族。其中miR159是检测到的最大家族,拥有12个成员；miR171拥有11个成员；miR166拥有8个成员；miRl64拥有7个成员；miRl67和miR169均拥有6个家族成员。miR160和miR319均拥有5个成员；miR156, miR168, miR172, miR398和miR399均拥有3个成员；miR157, miR393和miR478均拥有2个成员；其余的19个家族：miR161, miR162, miR165, miR390, miR391, miR394, miR395, miR396, miR397, miR407, miR414, miR416, miR426, miR447, miR477, miR479, miR529, miR530和miR535均在苹果中检测到一个成员。2.利用niRNA数据库,将苹果中检测到的来自miRNA数据库的35个miRNA家族成员与拟南芥、水稻、毛果杨等9种植物中的miRNA进行了序列比对,结果发现有25个家族在拟南芥中高度保守,分别是niR156, miR157, miR159, miR160, miR162, miR164, miR165, miR166, miR167, miR168, miR169, miR171, miR172, miR3I9, miR390, miR391, miR393, miR394, miR395, miR396, miR397, miR398, miR399, miR414和miR447。同时除了miR157, miR165, miR168, miR391, miR414和miR447家族外的19个家族在水稻中同样高度保守,另外,还有2个家族,分别是miR416和miR426也在水稻中高度保守。miR156, miR157, miR159, miR160, miR162, miR164, miR166, miRl67, miR168, miR169, miR171, miR172, miR319, miR390, miR393, miR394, miR395, miR396, miR397, miR398, miR399, miR477和miR478共23个家族在毛果杨中高度保守。3.采用茎环引物RT-PCR策略,利用RT-PCR技术成功地在苹果叶片中检测了14种保守miRNA的表达；在叶片、嫩茎、幼果和根等不同器官中检测了5种保守miRNA的表达；同时在新梢、一年生枝、二年生枝和多年生枝等不同枝龄的苹果叶片中检测了6种保守miRNA的表达。表明利用茎环引物的RT-PCR策略所建立的体系是定性检测苹果植株中保守miRNA的有效方法。4.利用半定量RT-PCR技术,采用茎环引物的RT-PCR策略检测了10种miRNA在苹果离体试管苗与田间苗中的差异表达,发现两种不同的繁殖方式中miRNA存在明显的表达差异,其中miRl56和miRl57在试管苗中表达明显高于其在田间苗中的表达。5.根据EST数据库信息和生物信息学软件预测了苹果中相关miRNA的前体结构,预测了11个不同的miRNA前体可分为9个保守的植物miRNA的家族（miR157,miR159, miR160, miR162, miR167, miR172, miR319, miR393和miR398）。前体结构预测显示,这些序列均具有前体miRNA的茎环结构特征。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 miRNA的发现和特点
• 1.1.1 miRNA的发现
• 1.1.2 miRNA的特点
• 1.2 miRNA的鉴定及命名
• 1.2.1 miRNA的鉴定
• 1.2.2 miRNA的命名
• 1.3 植物miRNA的生物合成和作用机制
• 1.3.1 miRNA的生物合成
• 1.3.2 miRNA的作用机制
• 1.4 植物miRNA的功能
• 1.4.1 miRNA对植物生长发育的影响
• 1.4.2 miRNA对植物发育时序的调控作用
• 1.4.3 miRNA对植物逆境胁迫应答的调节作用
• 1.5 本研究的目的意义
• 第二章 苹果植株中miRNA的基因芯片检测
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 芯片探针的设计
• 2.1.4 芯片的合成与点制
• 2.1.5 苹果小分子RNA的提取
• 2.1.6 苹果小分子RNA的检测
• 2.1.7 miRNA样品的荧光标记
• 2.1.8 芯片杂交与清洗
• 2.1.9 图像获得和数据处理
• 2.1.10 芯片中检测到的miRNA的保守性分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 苹果小分子RNA的分离和检测
• 2.2.2 芯片检测到的苹果植株中的miRNA
• 2.2.3 苹果植株中的miRNA的保守性分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 基因芯片技术的应用
• 2.3.2 miRNA存在的广泛性和序列的保守性
• 2.4 小结
• 第三章 苹果miRNA的茎环RT-PCR检测体系的建立及其应用
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 引物的设计与合成
• 3.1.4 核酸提取方法
• 3.1.5 利用茎环引物的RT-PCR
• 3.1.6 半定量RT-PCR
• 3.1.7 PCR特异片段的回收
• 3.1.8 PCR产物克隆测序
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 苹果总RNA的分离
• 3.2.2 苹果植株中miRNA检测体系的建立
• 3.2.3 苹果植株中miRNA检测体系的优化
• 3.2.4 苹果植株中miRNA的定性检测
• 3.2.5 苹果植株中miRNA的定量分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 茎环RT-PCR鉴定miRNA的方法
• 3.3.2 miRNA的半定量检测方法
• 3.3.3 miRNA表达的特点
• 3.4 小结
• 第四章 苹果miRNA的前体结构预测
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 苹果miRNA对应的EST序列的检索
• 4.1.2 miRNA前体结构的预测方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 苹果miRNA对应的EST序列检索结果
• 4.2.2 苹果miRNA前体结构的预测分析
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文