论文摘要
树突状细胞（dendritic cells,DC）是目前发现的功能最强大的专职抗原递呈细胞（antigen presenting cells,APC）,参与抗原的摄取、加工及提呈。DC最大的特点是能够显著刺激处女型或初始型T细胞（naive T cells）增殖,因此DC是机体免疫反应的始动者,在诱导免疫应答过程中具有独特的地位。DC在体内广泛分布,是一种异质性细胞群体,具有多种不同的形态、表型和功能。不成熟的树突状细胞（immature dendritic cells,iDC）具有高效的抗原摄取和处理能力,因其低表达共刺激分子和主要组织相容复合体（major histocompatibility complex,MHC）分子,对T细胞的激活作用差,故其抗原提呈能力较弱。遇到感染等刺激信号后,iDC捕获抗原,随即对抗原进行加工处理,并同时向淋巴器官迁移,逐渐成熟,增殖并分泌多种细胞因子,高表达MHC类分子,上调协同刺激分子如CD40、CD80/CD86、CD58的表达,其呈递抗原的能力逐渐增强,而摄取、加工处理抗原的能力逐渐减弱,最终发育为成熟树突状细胞（mature dendritic cells,mDC）。DC的功能特点与其成熟状态密切相关,因此,调控其表型和功能的成熟具有重要意义。胆囊收缩素（cholecystokinin,CCK）是一种典型的脑肠肽,不但具有胃肠激素的功能,还以神经递质/神经调质的形式发挥着重要的作用。八肽胆囊收缩素（cholecystokinin octapeptide,CCK-8）是体内具有CCK全部生物活性的最小分子形式。自上世纪九十年代以来,人们注意到CCK-8对免疫细胞功能活性有影响,发现CCK-8具有调节免疫细胞增殖、趋化、黏附、免疫杀伤、产生炎性介质及细胞因子等多种功能。本室以往研究发现,CCK-8通过进一步激活LPS诱导的巨噬细胞cAMP-PKA信号通路,抑制IκB蛋白磷酸化及NF-κB活性,下调B7.1和B7.2表达,从而抑制巨噬细胞的协同刺激活性。以上结果显示CCK-8具有免疫调节功能的良好前景。DC的成熟可由多种刺激物触发,包括细菌、病毒、促炎症细胞因子（IL-1、TNF-α等）、接触性变态反应原等。其中,脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是DC成熟的强有力促进物,LPS介导DC活化的信号通路错综复杂,其中,丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase ,MAPK）-NF-κB通路是LPS诱导DC成熟的重要信号转导机制。我们前期的研究表明,CCK-8对LPS诱导的巨噬细胞p38 MAPK-NF-κB通路具有抑制性调节作用,但CCK-8对LPS诱导的DC成熟过程及其相关的MAPK—NF-κB信号通路是否有调节作用,均未见相关报道。因此本实验以体外培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells,BM-DC）为对象,系统研究CCK-8对LPS作用下细胞内MAPK—IκB—NF-κB—DC表型和功能变化这条通路的影响,探讨CCK-8对LPS诱导DC成熟过程及其信号通路的影响,以进一步揭示CCK-8免疫调节的作用机制。1 CCK受体在树突状细胞的表达骨髓细胞自C57BL/6小鼠股骨和胫骨骨髓中分离,在含有GM-CSF的完全培养基中培养7天。收集悬浮和疏松贴壁细胞,然后用免疫磁珠分选纯化,获得iDC,并用流式细胞术鉴定其纯度。分选后的细胞分别加入一抗山羊抗CCK-1R/2R抗体,二抗FITC标记的兔抗山羊IgG,最后置于流式细胞仪上检测,同时以仅孵育二抗FITC-IgG的细胞作为同型对照。或者分选后的细胞均匀涂于载玻片,4%多聚甲醛固定后,分别加入一抗山羊抗CCK-1R/2R抗体,二抗FITC标记的兔抗山羊IgG,另采用PBS代替一抗作阴性对照。最后甘油封片后于荧光显微镜下观察并照相。结果显示:（1）细胞培养7d分选后,经流式细胞仪鉴定BM-DC纯度在90%以上。（2）经流式细胞术检测和荧光显微镜观察证实CCK-1R和CCK-2R在BM-DC细胞中均有表达。该结果为CCK-8对生理及病理条件下DC发挥调节作用提供了直接的结构依据,为进一步完善CCK-8的免疫调节功能提供了基础。2 CCK-8对LPS诱导树突状细胞成熟的影响LPS诱导DC成熟过程中伴随细胞表型和功能的改变,本研究观察CCK-8对LPS活化DC过程中细胞表型（CD80、CD86、MHCII表达）及功能（吞噬功能、分泌细胞因子及协同刺激能力）的影响。分选纯化后的iDC,分为八组:control组;LPS组;LPS+CCK-8（10-10、10-8、10-6 mol·L-1）组;CR1409组即LPS+CCK-8（10-8 mol·L-1）+CR1409（10-6 mol·L-1）组;CR2945组即LPS+CCK-8（10-8 mol·L-1）+CR2945（10-6 mol·L-1）组;CCK-8（10-8 mol·L-1）组。收集不同因素作用后的各组细胞,分别加入荧光标记的抗CD80、抗CD86和抗MHCII的抗体,孵育30 min,采用流式细胞术分析细胞表面CD80、CD86和MHCII含量的变化。各组细胞均加入FITC-dextran作用1h后,收集细胞,采用流式细胞术检测细胞吞噬能力的变化。用ELISA法检测细胞培养上清中IL-12p40、IL-12p70、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。用免疫磁珠分选法从BALB/c小鼠脾细胞分离CD4+T细胞,按10:1数量比与上述各组树突状细胞共同体外培养72 h,采用MTT法测定CD4+T细胞增殖程度以反映树突细胞的协同刺激活性。数据用x±s表示,用SPSS统计分析软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析（ANOVA）,用最小显著差法（least significant difference,LSD）作两两比较,P<0.05为有显著性差异。结果显示:（1）LPS组CD80、CD86和MHCII的表达（699.87±29.21、703.87±37.54、775.60±51.53）均较对照组（412.20±34.58、383.97±60.52、488.23±51.29）增加（P<0.01） ;LPS+CCK-8（10-10、10-8、10-6 mol·L-1）组CD80（597.63±37.84、522.37±44.22、499.67±34.16）、CD86（607.83±24.58、557.23±26.89、475.30±45.43）、MHCII（674.23±36.14、618.00±25.49、573.20±32.64）的表达均较LPS组明显降低,CCK-8以剂量依赖性抑制LPS诱导BM-DC表型的成熟（P<0.05,P<0.01）;CR1409组（621.47±32.14、642.83±39.81、696.50±40.95）和CR2945组（595.03±68.08、654.30±51.38、693.67±50.55） CD80、CD86和MHCII的表达均较LPS+CCK-8（10-8 mol·L-1）组提高,即CCK-1和CCK-2受体拮抗剂CR1409、CR2945部分逆转了CCK-8的抑制作用（P<0.05,P<0.01）;与对照组相比,单独CCK-8对CD80、CD86和MHCII表达无明显影响（P>0.05）。（2）对照组细胞具有较高的吞噬能力（74.53±5.44%）,LPS组吞噬能力减弱（21.46±3.13%）（P<0.01）。LPS+CCK-8（10-10、10-8、10-6 mol·L-1）组吞噬能力（40.14±6.61%、46.61±5.96%、60.07±4.81%）均较LPS组增强,即CCK-8以剂量依赖方式抑制LPS诱导DC摄取葡聚糖能力的下调（P<0.01）;CR1409组（34.38±5.09%）和CR2945组（36.33±4.84%）吞噬能力均较LPS+CCK-8（10-8 mol·L-1）组降低,即二者部分逆转了CCK-8的抑制作用（P<0.05）;与对照组相比,单独CCK-8组吞噬能力（70.16±8.27%）无明显改变（P>0.05）。（3）与对照组（0.27±0.05 ng/ml、0.36±0.07 ng/ml）相比,单独CCK-8孵育后,IL-12 p40、p70表达量无明显改变（P>0.05）,LPS明显促进IL-12p40、p70表达（8.35±1.33 ng/ml、0.71±0.03 ng/ml） （P<0.01）;LPS+CCK-8（10-10、10-8、10-6 mol·L-1）组IL-12p40 （13.03±1.52 ng/ml、13.77±0.64 ng/ml、17.61±2.69 ng/ml）和IL-12p70（0.76±0.05 ng/ml、0.91±0.06 ng/ml、0.95±0.13 ng/ml）较LPS组进一步增高,即在LPS存在情况下,CCK-8剂量依赖性促进IL-12 p40、p70的表达（P<0.01）;而CR1409（8.75±1.70 ng/ml、0.67±0.07 ng/ml）和CR2945（10.57±2.17 ng/ml、0.72±0.05 ng/ml）可减弱CCK-8的促进效应（P<0.05,P<0.01）。DC自发产生TNF-α、IL-6和IL-1β的量非常少,低于我们检测的下限。单独CCK-8对三者分泌无明显影响。LPS孵育24h后,细胞上清中TNF-α（4.00±0.18 ng/ml）、IL-6（14.44±0.98 ng/ml）和IL-1β（0.55±0.06 ng/ml）的量明显增多（P<0.01）;LPS+CCK-8（10-10、10-8、10-6 mol·L-1）组TNF-α（3.50±0.09 ng/ml、3.17±0.14 ng/ml、2.18±0.10 ng/ml）、IL-6（13.80±0.87 ng/ml、12.21±0.53 ng/ml、9.30±0.28 ng/ml）和IL-1β（0.51±0.05 ng/ml、0.37±0.04 ng/ml、0.26±0.05 ng/ml）的分泌量均较LPS组降低,CCK-8以剂量依赖方式抑制了LPS诱导DC分泌TNF-α、IL-6和IL-1β;而CR1409或CR2945可减弱CCK-8的抑制效应（P<0.05,P<0.01）。（4）DC刺激同基因异体小鼠脾T淋巴细胞增殖反应程度用细胞吸光度A值表示。LPS组A值（0.82±0.06）明显高于对照组（0.17±0.03）（P<0.01）;CCK-8组（0.18±0.01）与对照无明显差别（P>0.05）。LPS+CCK-8（10-10、10-8、10-6 mol·L-1）组分别为0.72±0.06、0.55±0.08、0.32±0.06,均较LPS组降低（P<0.05,P<0.01）,CCK-8降低LPS诱导DC刺激同种异体T细胞增殖的活性,并呈剂量依赖效应;而CR1409（0.66±0.09）或CR2945（0.66±0.06）可减弱CCK-8的抑制效应（P<0.05,P<0.01）。上述结果表明CCK-8除协同LPS诱导DC分泌IL-12外,对LPS诱导DC表型和功能的成熟具有抑制性调节作用。3 CCK-8对LPS诱导树突状细胞MAPK活性的影响MAPK是细胞内信号蛋白网络中重要的成员,已知MAPK亚家族成员ERK、p38 MAPK和JNK参与了LPS诱导DC成熟过程的调控。结合前部分实验结果,本部分将主要观察CCK-8对LPS活化的DC细胞中p38MAPK、JNK1/2、ERK1/2活性的影响,旨在进一步明确CCK-8对LPS作用下DC活性和功能改变的具体信号转导机制。分选纯化的iDC在不同刺激因素作用后（分组同前）,提取细胞胞浆蛋白,用Western blot技术分析胞浆中p38 MAPK、JNK1/2、ERK1/2蛋白的活化水平。数据用x±s表示,用SPSS统计分析软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析（ANOVA）,用最小显著差法（least significant difference,LSD）作两两比较,P<0.05为有显著性差异。结果显示:（1）各组间总p38 MAPK表达略有差异,但无统计学意义（P>0.05）。LPS孵育后,DC细胞p-p38蛋白表达为对照组的1.54倍,较对照组升高（P<0.01）;单独CCK-8对p38 MAPK的活化无明显影响（P>0.05）;LPS+CCK（10-10、10-8、10-6 mol·L-1）组p-p38 MAPK表达分别为LPS组的1.19、1.31和1.43倍,较LPS组增高（P<0.05,P<0.01）;CR1409组和CR2945组p-p38 MAPK表达较LPS+CCK（10-8 mol·L-1）组分别降低18.31%和15.49%,CR1409和CR2945部分逆转了CCK-8对p-p38 MAPK的活化作用（P<0.05,P<0.01）。（2）各组间总JNK表达略有差异,但无统计学意义（P>0.05）。对照组p-JNK1/2水平较低。LPS组p-JNK1/2表达分别为对照组的5.30和5.16倍,较对照组明显增加（P<0.01）。LPS+CCK（10-10、10-8、10-6 mol·L-1）组p-JNK1/2水平较LPS组分别降低46.41%、44.69%;54.49%、54.06%;64.67%、63.13% （P<0.01）。CR1409组和CR2945组p-JNK1/2分别为LPS+CCK（10-8 mol·L-1）组的1.22、1.25倍和1.28、1.28倍,CR1409和CR2945部分逆转了CCK-8对LPS诱导JNK1/2活化的抑制作用（P<0.01）。（3）各组间总ERK表达略有差异,但无统计学意义（P>0.05）。对照组p-ERK1/2水平较低,单独CCK对ERK1/2活化无明显影响。LPS组p-ERK1/2水平增高,分别约为对照组的3.79、4.36倍（P<0.01）;LPS+CCK组p-ERK1/2表达较对照组增高,但较LPS组无明显改变（P>0.05）。上述结果表明,CCK-8协同LPS诱导DC细胞p38 MAPK的磷酸化,降低了LPS对DC细胞JNK活化的诱导作用,对LPS诱导ERK通路的活化无明显影响。提示,CCK-8抑制LPS诱导DC表型和功能成熟而协同LPS促进IL-12分泌,可能与其对MAPK通路调节的多样性有关,同时也提示CCK-8可能对MAPK之外的其它信号通路有调控作用。4 CCK-8对LPS诱导树突状细胞NF-κB活性的影响前一部分已证实CCK-8对LPS诱导DC细胞中MAPK通路的活化具有调节作用,NF-κB是MAPK下游的转录因子之一,并且已有研究表明NF-κB通路在LPS诱导DC成熟过程中起重要作用。因此,本部分主要观察CCK-8对LPS诱导的树突状细胞NF-κB活性及IκB蛋白表达水平变化的影响。分选纯化的DC在不同刺激因素作用后（分组同前）,提取细胞胞核蛋白,用EMSA技术检测细胞NF-κB活性;提取细胞胞浆蛋白,用Western blot技术分析胞浆中IκB蛋白的表达水平。数据用x±s表示,用SPSS统计分析软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析（ANOVA）,用最小显著差法（least significant difference,LSD）作两两比较,P<0.05为有显著性差异。结果显示:（1）LPS孵育DC后,细胞内NF-κB活性明显高于对照组（P<0.01）,而用CCK-8处理后,剂量依赖性地抑制了LPS诱导的NF-κB活性增高,10-10、10-8、10-6 mol·L-1 CCK-8的抑制率分别为20.27%、35.37%和47.26%（P<0.01）。CCK-8的作用可被CCK-1R拮抗剂CR1409和CCK-2R拮抗剂CR2945所减弱（P<0.01）。CCK-8单独孵育对细胞NF-κB活性无明显影响（P>0.05）。同时用同源性寡核苷酸（含NF-κB结合位点）及异源性寡核苷酸（含AP-2结合位点）作为竞争物证实了DNA-蛋白结合的特异性。（2）各组间总IκB蛋白表达略有不同,但无显著性差异（P>0.05）。LPS孵育DC后,胞浆中pIκB蛋白水平明显高于对照组,为对照组的5.2倍（P<0.01）;CCK-8单独孵育对细胞pIκB蛋白水平无明显影响（P>0.05）。LPS+CCK（10-10、10-8、10-6 mol·L-1）组pIκB蛋白水平较LPS组分别降低15.38%、34.62%和44.23%（P<0.01）。CR1409组和CR2945组pIκB蛋白表达均为LPS+CCK（10-8 mol·L-1）组的1.32倍,CR1409和CR2945部分逆转了CCK-8对LPS诱导pIκB表达的抑制作用（P<0.01）。上述结果表明,CCK-8可抑制LPS诱导的NF-κB活性,其上游信号机制为通过CCK受体介导而抑制IκB蛋白磷酸化。结论本研究首次系统研究了CCK-8对LPS作用下小鼠骨髓来源的树突状细胞表型和功能成熟的影响,并从受体、蛋白激酶、核转录因子多个环节对其相关信号转导机制进行了探讨,结论如下:1小鼠骨髓来源的树突状细胞表面存在两种CCK受体亚型:CCK-1R和CCK-2R。为进一步研究CCK-8对DC调节作用提供了基础。2 CCK-8可抑制LPS诱导的DC成熟、促炎症细胞因子的分泌以及促T细胞增殖的能力,并可促进IL-12的分泌。表明CCK-8对DC有双向调节作用,提示CCK-8可能通过调控DC分化成熟,进而成为一些与DC过度活化有关的自身免疫性疾病的潜在治疗因子。3 CCK-8促进LPS诱导IL-12分泌增加可能与其促进p38 MAPK活化,抑制JNK活化有关。4 CCK-8抑制LPS诱导的DC成熟是通过抑制NF-κB活性实现的。本研究首次证实CCK-8对LPS诱导DC分泌IL-12具有促进作用,对LPS诱导DC表型和其它功能方面的成熟具有抑制性调节作用,该机制可能与CCK-8通过CCK-1R、CCK-2R介导对MAPK—NF-κB这条信号通路具有调节作用有关。提示对于存在DC过度活化的一些自身免疫性疾病的治疗中,CCK-8可能是一种潜在的有效治疗因子。但DC成熟的不同阶段和具体成熟过程是被复杂而精确的调控着,其中可能伴随多种信号通路的参与,有关CCK-8对DC功能的调节及其信号通路的影响等作用,仍有待进一步研究。
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- [1].CCK-8试剂在血液毒理学检测中的应用[J]. 中国卫生检验杂志 2013(03)
- [2].CCK-8法检测狗脊不同炮制品对成骨细胞的影响[J]. 中国中药杂志 2013(24)
- [3].CCK-8法评价口腔粘结材料的体外细胞毒性研究[J]. 口腔医学研究 2011(08)
- [4].CCK-8试剂用于测定活细胞数量的细节研究[J]. 生物技术世界 2016(05)
- [5].细胞增殖检测(CCK-8检测法)最佳实验条件的确定[J]. 国外畜牧学(猪与禽) 2017(05)
- [6].CCK-8对糖尿病大鼠胰岛细胞损伤保护相关蛋白质的实验分析[J]. 中国老年学杂志 2009(21)
- [7].捏脊对厌食大鼠下丘脑和血浆CCK-8的影响[J]. 四川中医 2008(10)
- [8].CCK-8法检测药物影响肿瘤细胞增殖的优化研究[J]. 药学研究 2016(02)
- [9].CCK-8与内源性阿片系统在吗啡依赖中的相互作用[J]. 中国药理学通报 2010(11)
- [10].CCK-8法与MTT法检测乳腺上皮细胞活性的条件比较研究[J]. 黑龙江畜牧兽医 2017(04)
- [11].MTT法与CCK-8法检测兔视网膜色素上皮细胞活性的比较研究[J]. 中国民族民间医药 2017(06)
- [12].CCK-8法和MTT法评价医用抗菌不锈钢细胞毒性的比较研究[J]. 口腔医学 2012(01)
- [13].CCK-8对脂多糖性肺损伤大鼠肺组织中硫化氢生成的抑制作用[J]. 中国病理生理杂志 2010(02)
- [14].CCK-8与内源性阿片系统在吗啡依赖过程中的相互作用[J]. 中国药物依赖性杂志 2010(05)
- [15].针刀松解对腰椎间盘突出症根性神经痛大鼠中枢与外周血CCK-8、5-HT的影响[J]. 上海针灸杂志 2020(06)
- [16].CCK-8检测新鲜脐带组织中细胞活性的初步研究[J]. 中国输血杂志 2016(06)
- [17].齐刺胆的下合穴对胆绞痛豚鼠β-EP和CCK-8影响的研究[J]. 针灸临床杂志 2014(10)
- [18].CCK-8法检测九香虫血淋巴对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用[J]. 环境昆虫学报 2017(01)
- [19].MTT法和CCK-8法检测中药抗病毒活性成分细胞毒性的比较[J]. 湖北大学学报(自然科学版) 2017(03)
- [20].CCK-8人工神经修复大鼠坐骨神经长段缺损的实验研究[J]. 中国社区医师 2016(19)
- [21].CCK-8法检测表没食子儿茶素没食子酸酯对胰腺癌PANC-1细胞增殖的抑制作用[J]. 胃肠病学和肝病学杂志 2010(10)
- [22].针药合用刺激嗅觉系统对血管性痴呆模型大鼠学习记忆及大脑边缘叶CCK-8含量的影响[J]. 山东中医药大学学报 2009(05)
- [23].噻唑兰法和CCK-8法检测小鼠淋巴细胞增殖反应的比较[J]. 感染、炎症、修复 2012(04)
- [24].捏脊疗法对幼龄厌食大鼠血浆CCK-8、β-EP的影响[J]. 江苏中医药 2008(02)
- [25].CCK-8对LPS诱导小鼠骨髓来源树突状细胞分泌IL-12的影响[J]. 中国药理学通报 2008(03)
- [26].CCK-8法检测兔筋膜成纤维细胞增殖活性之最佳测试条件研究[J]. 中外医学研究 2011(12)
- [27].CCK-8对链佐霉素所致糖尿病大鼠的饮食控制作用[J]. 陕西医学杂志 2010(07)
- [28].CCK-8法定量检测亚甲蓝对人髓核细胞的毒性[J]. 中国组织工程研究 2018(16)
- [29].CCK-8对内毒素血症小鼠腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2表达及协同刺激功能的影响[J]. 中国病理生理杂志 2008(12)
- [30].CCK-8对吗啡成瘾大鼠戒断症状及尾核内c-jun蛋白表达的影响[J]. 中国药理学通报 2008(09)
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