初级筛选模型的建立及具有潜在抗肿瘤活性物质的筛选

论文摘要

肿瘤是一种严重危害人类健康和生命的疾病,至今仍没有能够完全治愈它的有效药物。然而,自然界中微生物的多样性及其代谢产物的多样性,为我们发现新药提供了不竭的动力。尤其是极端环境中的微生物,其代谢产物在化学结构与作用机制等方面具有更高度的多样性和特异性,从中寻找具有潜在抗真菌、抗肿瘤活性作用的物质,是当前新药研究开发的一个重要途径。在天然抗肿瘤药物研究中,针对新靶点采用新的模型与检测方法,建立合理的抗肿瘤药物筛选体系显得尤为重要。其中以微管系统为靶点筛选新的活性物质的研究方法已引起广泛关注。鉴于真菌细胞和动物细胞有着共同的真核细胞生理基础,且发现药物的抗肿瘤效果和真菌形态变异之间有较好的对应关系,很多抗肿瘤药物在适当的浓度下都能改变真菌的形态,抑制孢子萌发或者使菌丝体畸变。所以开发利用真菌作为靶标菌,以其形态变异为活性指标,筛选具有潜在抗肿瘤活性的物质,具有非常深远的研究价值。目前应用较为广泛的真菌模型是由日本东京大学分子细胞生物研究所岩崎成夫等建立的稻瘟霉（Pyricularia oryzae）活性筛选模型,国内外很多学者已经利用该模型筛选出了数千种具有潜在抗肿瘤活性的化合物,其中Rhizoxin、Fusarielin A和Ansamitocin P-3几种化合物已被成功开发为抗真菌和抗肿瘤新药。但在实际应用过程中发现该模型有一些局限:1)有一定程度的漏筛率,限制了其对抗肿瘤药物筛选的范围;2)稻瘟霉培养技术要求高,产孢周期长;3)分生孢子个体小、颜色浅,不易观察和评价。于是,研究者们开始探索并尝试建立一些新的真菌筛选模型。温占波和鲍时翔等分别建立了茄交链孢霉（Alternaria solani）和镰刀菌（Fusarium oxysporum）T-6筛选模型,发现茄交链孢霉比稻瘟霉更敏感和更易观察,镰刀菌模型样品处理量大、快捷、费用低,而且比稻瘟霉更易产孢。本实验室在筛选针对植物病原真菌的拮抗微生物时发现,一些拮抗微生物可以抑制某些病原真菌的萌发或继续生长,并致使其发生形态畸形、原生质浓缩或菌体断裂等其它现象。这些作用效果与稻瘟霉模型受抑制效果类似,且在某些方面更优于稻瘟霉模型,例如培养条件及时间、畸变种类、观察效果等等,从而引发了我们从中去探索有无比现有筛选模型更加合适的抗真菌、抗肿瘤活性物质筛选模型。本研究主要从山西运城盐湖中部风干土样中筛选真菌菌株,从中选择具有潜在能力的、可作为筛选模型的菌株,接着评价其作为筛选模型菌株的可行性,建立一种新的抗真菌、抗肿瘤药活性物筛选模型,最后利用该菌株作为模型筛选来自盐湖或其它环境中拮抗活性较好的菌株,并研究其次级代谢产物潜在的抗真菌、抗肿瘤活性。本研究取得的主要结果如下:1.菌株的分离纯化和筛选。从两次采集的山西运城盐湖中部风干土样中,应用土壤直接分离法和土壤悬浮液分离法,每种方法的每个土壤稀释倍数都分别设6个不同盐浓度:0%、2.5%、5%、7.5%、10%和12.5%,共获得43株长势较好、传代较稳定的菌株。根据这些菌株的形态特征和培养特征,发现其中YH-1菌株的一些特征尤为突出:1)生活史简单;2)易培养,它对生长环境适应能力很强,在盐浓度0%--10%的PDA培养基中,都可以正常生长;3)易获得,生长周期和产孢时间短（5-6d）、产孢量大;4)易观察,孢子个体较大,菌体产黑色素多,分生孢子和分生孢子梗均为暗褐色。可作为待选模型菌株。2.待选菌株的初步考查和筛选模型的建立。以稻瘟霉作为对照,选择不同抗肿瘤药物处理YH-1菌株,考查YH-1作为模型的可能性。将11种临床应用的抗肿瘤药物应用96孔板法,对稻瘟霉和YH-1孢子进行作用,观察不同药物、不同加药量、不同时间段（2h,4h,6h）等对靶标菌孢子及菌丝形态变化的影响,且将形态异常（抑制、卷曲、末端膨大等等）指标化。结果显示,YH-1对这些抗肿瘤药物的敏感性要大于稻瘟霉,且较稻瘟霉具有更广的检测域;镜检发现与稻瘟霉相比,畸变体种类较多,易于辨认,用药后最佳观察时间在6-8小时,而稻瘟霉最佳观察时间在14小时左右。所以,YH-1菌株很有潜力成为抗肿瘤活性药物初筛模型的靶标菌。经菌体培养、菌落观察及菌体形态的显微观察,初步确定菌株YH-1为细交链孢霉（Alternaria tenuissima）真菌。3.筛选模型的初步应用及活性菌株的筛选。以稻瘟霉和YH-1为筛选模型,对42株菌进行活性筛选。结果发现大部分菌株对稻瘟霉有明显抑制作用,其中抑菌率在60%以上的有16株,以Yhx-4菌株的抑菌率最高（90.81%）;同时发现对稻瘟霉有抑制作用的大部分菌株对初步建立的筛选模型菌株YH-1也表现出了明显的抑制作用,有12株菌的抑菌率也均在60%以上,仍以Yhx-4菌株的抑制作用最为显著,抑菌率达到89.02%。然后将活体实验有抑菌作用的不同种菌株制备发酵液,考察其发酵产物的活性。结果发现,YH-7菌株的发酵液对稻瘟霉和YH-1抑制效果明显且达到最高,抑菌率分别达到了68.34%和64.29%。同时也进一步证实了YH-1可作为筛选模型的可行性。4.拮抗菌产生的活性物质的初步研究。对YH-7发酵液中的有效抗菌物质进行了初步研究。首先确定了发酵液最佳发酵天数（9d）,此时发酵液抗菌作用最好;然后利用饱和硫酸铵沉淀法初步确定了发酵液中有效抗菌成分主要为蛋白类物质,并且通过硫酸铵分级沉淀确定了硫酸铵沉淀的最佳饱和度（85%）;再通过蛋白酶K、变性剂酚-氯仿处理进一步验证抗菌物质主要为蛋白类物质。96孔板实验得出,YH-7发酵液中的有效抗菌蛋白在最大浓度时,可以使筛选模型稻瘟霉和YH-1孢子及菌丝体内含物聚集,完全抑制孢子及菌丝体的生长,在适当的浓度,也可以使YH-1畸变,产生末端膨大现象。因此,YH-7发酵液中的有效抗菌蛋白很有可能开发成为抗真菌、抗肿瘤的有效成分。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 抗肿瘤药物的研究进展
• 1.1.1 肿瘤发病情况
• 1.1.2 抗肿瘤药物研究的重要性
• 1.2 微生物来源抗肿瘤活性物质的研究进展
• 1.2.1 微生物的多样性
• 1.2.2 微生物来源抗肿瘤药物的发展
• 1.2.3 目前药物筛选热点：极端环境微生物
• 1.2.4 运城盐湖概况
• 1.3 以微管系统为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的建立
• 1.3.1 药物筛选模型建立的重要性
• 1.3.2 微管系统为靶点的筛选模型的研究
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第2章 运城盐湖土样中菌株的筛选
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试靶标菌株及盐湖土样
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 土壤直接分离法
• 2.2.2 土壤悬浮液分离法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 分离菌株类型特征
• 2.3.2 YH-1 菌株的培养特征
• 2.4 讨论
• 第3章 YH-1 模型的初步建立
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 抗肿瘤药物
• 3.1.3 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 孢子悬浮液的制备
• 3.2.2 96 孔板活性检测法
• 3.2.3 将形变指标化
• 3.2.4 菌株的初步鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 稻瘟霉
• 3.3.2 YH-1
• 3.3.3 YH-1 菌株的初步鉴定
• 3.4 讨论
• 第4章 不同菌株及发酵液对稻瘟霉和YH-1 生长的影响
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 供试菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 菌种活化
• 4.2.2 活体抑菌实验
• 4.2.3 发酵液的制备
• 4.2.4 发酵液滤纸片法抑菌实验
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 以稻瘟霉为靶标菌的活体平板对峙培养实验
• 4.3.2 以YH-1 为靶标菌的活体平板对峙培养实验
• 4.3.3 菌株发酵液的活性检测
• 4.4 讨论
• 第5章 YH-7 发酵液活性成分初步的分析
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 供试菌株
• 5.1.2 实验试剂
• 5.1.3 实验仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 发酵液不同发酵天数抑菌活性的比较
• 5.2.2 透析袋的处理
• 5.2.3 分级硫酸铵沉淀
• 5.2.4 蛋白酶K 消化
• 5.2.5 酚-氯仿抽提
• 5.2.6 96 孔板检测
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 不同天数
• 5.3.2 硫酸铵分级沉淀
• 5.3.3 蛋白酶K 和酚氯仿作用结果
• 5.3.4 96 孔板检测结果
• 5.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间取得的科研成果