黄芪蛋白自组装行为的研究

论文摘要

黄芪,为植物和中药材的统称,是补益类中药的代表。早先相关的研究多集中黄芪其他活性成分的研究,对蛋白的活性成分研究较少。本研究先对黄芪蛋白进行分离纯化,然后运用化学和生物化学的方法,对黄芪蛋白自组装颗粒的存在形态、基本性质以及药物包埋等方面进行研究。分离纯化得到的黄芪目的蛋白经SDS-PAGE测定其蛋白分子量大小为35.5kDa。通过氨基酸组成分析得到蛋白中富含谷氨酸（Glu,11.30%）、丝氨酸（Ser,11.12%）、天门冬氨酸（Asp,8.42%）和亮氨酸（Leu,8.17%）,而胱氨酸和色氨酸没有检测出。蛋白N-末端序列测定出其序列为AVXVEKPEVYKX?V,通过同源性分析,蛋白序列与其他已知蛋白序列的同源程度不高,且其他蛋白多来源于微生物,因此认为是一种新型蛋白。利用动态光散射检测分析,研究影响黄芪蛋白自组装纳米颗粒的条件。跟踪测定pH（3.3-10.3）、温度（60℃、80℃、100℃）、时间（0-120 min）对黄芪蛋白自组装纳米颗粒的平均粒径及Zeta电位的改变,结果显示得出在pH8.3,80℃,加热60 min的条件下该蛋白自组装纳米颗粒形成较稳定,表面Zeta电位为-26mV,且粒径分布均一,平均粒径为150.5 nm。并通过Folin-酚法测定游离蛋白的浓度,可知颗粒自组装率为89.6%。此外,使用提纯的黄芪甲苷（AST）,以上述黄芪蛋白为载体,制备装载了黄芪甲苷的蛋白纳米颗粒,采用HPLC测定游离的黄芪甲苷浓度,可知其装载率为为35.3%。装载黄芪甲苷后的蛋白纳米颗粒的平均粒径相较于撞在前增加了19nm,且稳定性也有所提高,表面Zeta电位为-26.1 mV。扫描电镜（SEM）下,黄芪蛋白自组装纳米颗粒多呈现球形或椭圆形,粒径在100 nm～200 nm之间且较为均一,与动态光散射的测定结果一致。测定黄芪蛋白原液、蛋白自组装颗粒、AST-蛋白自组装颗粒在体外细胞增殖活性的影响,结果显示,其中,黄芪蛋白对MDCK细胞毒性明显,其细胞半致死剂量为112 μg/mL;蛋白颗粒在所有测试浓度下对MDCK细胞、Hep-G2细胞、均无明显毒性作用,仅在最高浓度（250 μg/mL）下对L-02、Caco-2有轻微毒性作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 中药黄芪的概述
• 1.1.1 中药黄芪简介
• 1.1.2 中药黄芪的化学成分
• 1.1.2.1 黄芪多糖类
• 1.1.2.2 黄芪黄酮类
• 1.1.2.3 黄芪皂苷类
• 1.1.2.4 黄芪蛋白的研究
• 1.1.3 中药黄芪药理活性的研究进展
• 1.1.3.1 抗肿瘤作用
• 1.1.3.2 保肝作用
• 1.1.3.3 抗病毒作用
• 1.1.3.4 对免疫系统的影响
• 1.1.3.5 其他药理活性
• 1.1.4 黄芪的临床应用
• 1.1.4.1 呼吸系统疾病
• 1.1.4.2 消化系统疾病
• 1.1.4.3 心脑血管疾病
• 1.1.4.4 其他临床应用
• 1.2 中药蛋白的药理活性
• 1.2.1 抗肿瘤活性
• 1.2.2 抗病毒活性
• 1.2.3 免疫调节活性
• 1.2.4 其他生物活性
• 1.3 植物中几种蛋白的研究概况
• 1.3.1 凝集素
• 1.3.2 胰蛋白酶抑制剂
• 1.3.3 几丁质酶
• 1.4 中药纳米颗粒的研究
• 1.4.1 中药汤剂中的胶体体系
• 1.4.2 中药与纳米技术简介
• 1.4.3 中药纳米颗粒的研究方法
• 1.4.4 蛋白的自组装行为与药物递送
• 1.5 本课题研究的意义和目的
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料与试剂
• 2.1.1 实验药材
• 2.1.2 主要材料与试剂
• 2.2 实验仪器与设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 黄芪汤剂的煎煮方法
• 2.3.2 黄芪饮片蛋白粗提液制备
• 2.3.2.1 黄芪饮片蛋白抽提
• 2.3.2.2 硫酸铵分级沉降
• 2.3.2.3 透析
• 2.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法
• 2.3.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）方法
• 2.3.5 黄芪蛋白的分离纯化
• 2.3.5.1 离子交换色谱法
• 2.3.5.2 疏水性高效液相色谱法
• 2.3.6 黄芪蛋白生化表征方法
• 2.3.6.1 Folin酚法测定黄芪提取液及分离纯化蛋白质含量
• 2.3.6.2 黄芪目标蛋白氨基酸组分分析
• 2.3.6.3 蛋白质序列分析
• 2.3.6.4 糖蛋白的过碘酸-席夫（PAS）染色法
• 2.3.6.5 蒽酮-硫酸法测板蓝根提取液中还原糖含量
• 2.3.7 黄芪蛋白自组装纳米颗粒条件初步探索
• 2.3.7.1 动态光散射技术（Dynamic Light Scattering,DLS）—粒径测量
• 2.3.7.2 颗粒稳定性Zeta-电位表征
• 2.3.7.3 pH对黄芪蛋白自组装颗粒的影响
• 2.3.7.4 加热时间对黄芪蛋白自组装颗粒的影响
• 2.3.7.5 温度对黄芪蛋白自组装颗粒的影响
• 2.3.8 黄芪蛋白自组装纳米颗粒的性质表征
• 2.3.8.1 尺寸排阻色谱与多角度激光光散射联用测定黄芪蛋白颗粒分子量
• 2.3.8.2 黄芪蛋白自组装纳米颗粒收率的测定
• 2.3.8.3 黄芪蛋白自组装纳米颗粒与黄芪甲苷的载药量的测定
• 2.3.8.4 扫描电子显微镜观察黄芪蛋白自组装颗粒的形貌特征
• 2.3.9 黄芪蛋白自组装颗粒的细胞活性实验
• 2.3.9.1 细胞复苏
• 2.3.9.2 细胞传代
• 2.3.9.3 细胞计数
• 2.3.9.4 MTT法测细胞相对数和相对活力
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 煎煮时间对黄芪水提取物蛋白质含量的影响
• 3.2 黄芪蛋白的分离纯化
• 3.2.1 黄芪饮片中蛋白质粗提液的制备
• 3.2.2 离子交换色谱
• 3.2.2.1 Macro-Prep High-S强阳离子离子交换色谱
• 3.2.2.2 Macro-Prep High-Q强阴离子离子交换色谱
• 3.2.3 疏水色谱
• 3.2.4 Folin-酚法测定各步骤黄芪蛋白的浓度
• 3.3 黄芪目的蛋白的理化性质表征
• 3.3.1 目的蛋白的分子量大小
• 3.3.2 Native-PAGE与SDS-PAGE的蛋白比较
• 3.3.3 氨基酸组成分析
• 3.3.4 N-末端序列测定
• 3.3.5 黄芪目标蛋白糖蛋白及还原糖测定结果
• 3.4 黄芪蛋白自组装纳米颗粒条件探索
• 3.4.1 不同pH对黄芪蛋白自组装颗粒的影响
• 3.4.2 不同加热时间对黄芪蛋白自组装颗粒的影响
• 3.4.3 利用凝胶色谱测定黄芪蛋白纳米颗粒的分子量
• 3.4.4 黄芪蛋白纳米颗粒的形成率
• 3.5 黄芪蛋白自组装纳米颗粒与黄芪甲苷的载药量的测定
• 3.5.1 黄芪蛋白自组装纳米颗粒与黄芪甲苷的装载率的测定
• 3.5.2 黄芪蛋白颗粒与AST-蛋白颗粒的性质表征
• 3.5.3 扫描电子显微镜观察黄芪蛋白自组装颗粒的形貌特征
• 3.6 黄芪蛋白与AST自组装纳米颗粒的细胞生物效应
• 总结与展望
• 总结
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 个人简历