梨树主要病害的分子检测及其生物化学协同控制研究

论文摘要

梨黑斑病、梨轮纹病和梨炭疽病是梨树三大主要病害,主要为害果实,叶片,也能侵染枝条。三种病害在我国普遍发生,均曾经大范围流行,造成重大损失。本文以三种病害为研究对象,建立了一套梨轮纹病和炭疽病的分子检测体系；测定了市场上常见化学药剂对三种病害病原菌的室内毒力指数；开展微生物-化学复配药剂田间防治三种病害的试验；荧光定量PCR监测生防菌处理后对梨叶片抗氧化相关基因的表达丰度,以探明生防机理,为三种病害有效控制提供理论和实践依据。主要研究内容如下：采集病样,分离纯化后获得梨炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）和轮纹病菌（Botryosphaeria berengeriana）菌株各20株,提取菌株基因组DNA。根据Genebank上炭疽属和轮纹属不同小种的ITS序列差异设计两对引物TJ1/TJ2和]LW1/LW2。由此建立的PCR体系可分别从炭疽菌菌株和轮纹菌菌株中扩增出317bp和325bp的特异性条带,对其他相似或相近的病原真菌则无扩增条带,表明设计的两对引物具有较高的种属专化性。本文还比较了常规PCR和巢式PCR技术的灵敏度。常规PCR技术检测梨轮‘纹病菌基因组DNA的灵敏度为10pg,巢式PCR技术的灵敏度为100ag,巢式PCR技术的灵敏度比常规PCR提高了约105倍。将不同稀释倍数（10个/ml、102个/ml、103个/ml、104·个/ml、105·个/ml）的轮纹病菌孢子悬浮液喷施在梨果上,提取梨果实DNA进行巢式PCR检测,均能成功地检测出病原菌。实验结果表明：利用巢式PCR技术,可以准确、灵敏地监测梨轮纹病菌在果园的种群消长动态。选取市场常见的20种化学药剂,对黑斑病菌A-1、梨轮纹病菌P-16、炭疽病菌Ⅰ-1进行室内毒力测定。结果表明,25%丙环唑乳油能有效抑制梨黑斑病菌、轮纹病菌、炭疽病菌菌丝生长,ECso值分别为0.031μg/ml、0.019μg/ml、0.020μg/ml。此外,10%苯醚甲环唑可湿性粉剂、25%咪酰胺乳油、40%氟硅唑乳油,30%己唑醇可湿性粉剂等四种药剂对梨轮纹、黑斑、炭疽病菌均表现出较高毒力,对菌丝的生长抑制作用较强,而50%烯酰吗啉可湿性粉剂、25%甲霜灵可湿性粉剂、15%三唑酮可湿性粉剂等药剂对菌丝的生长抑制作用较弱。本文评估了常见20种化学药剂对梨三大病害的抗药性风险,为果园的合理施药提供参考依据。目前生产上通常采用化学药剂防治上述三大病害。这种化学防治果树病害的方法不仅造成生态环境严重污染,而且直接增加了有毒化学物质在果品中的残留量,对人类健康带来危害。生物防治可以降低化学农药的使用量、降低梨果表面化学杀菌剂的残留量、保护生态环境。本研究利用一株对黑斑病、轮纹病和炭疽病均具有良好防治效果的枯草芽孢杆菌sf-628和25%丙环唑乳油复配（2:1）防治果树病害。田间试验结果显示,复配剂、化学药剂、sf-628对梨轮纹病的平均防治效果分别为86.2%、86.9%、64.9%；对梨炭疽病的平均防治效果分别为80.1%、78.8%、63.0%；对黑斑病的平均防治效果为83.1%、85.8%、77.0%。结果表明,复配药剂与常规使用的化学药剂防效大致相同,但是只使用1/3的化学药剂用量,实现生物农药部分替代化学药剂的作用。本文采用荧光定量PCR分析了喷施生防菌sf-628菌液后对梨叶片苯丙氨酸解氨酶（PAL）和过氧化氢酶（CAT）基因表达的影响。结果表明：生防菌液处理能诱导梨树产生抗性,提高梨叶片内部PAL和CAT基因表达水平。Real-time PCR分析结果表明：喷施生防菌sf-628菌液24h后,CAT和PAL基因表达丰度最高,分别为对照处理的3.5倍和2.4倍,而后它们的表达量逐渐下降。推测可能与生防菌在叶片的定殖情况相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 梨树主要病害研究进展
• 1 梨黑斑病研究现状
• 1.1 病原菌分类
• 1.2 病害症状
• 1.3 病原真菌生物学特性
• 1.4 致病条件研究
• 2 梨轮纹病研究现状
• 2.1 病原菌分类
• 2.2 病害症状
• 2.3 病原菌生物学特性
• 2.4 致病条件研究
• 3 梨炭疽病研究现状
• 3.1 病原菌分类
• 3.2 病害症状
• 3.3 病原菌生物学特性
• 3.4 致病条件研究
• 4 病害防治
• 5 展望
• 第二章 真菌病害分子检测方法研究进展
• 1 PCR分子诊断方法
• 1.1 植物病害检测中常用PCR分子标记技术
• 1.2 植物病害检测中新兴PCR分子技术的应用
• 2 分子检测方法存在的优缺点
• 2.1 所需模板量
• 2.2 重复性
• 2.3 多态性
• 2.4 可操作性
• 2.5 其它
• 3 应用前景展望
• 第三章 植物病害生物防治的研究进展
• 1 生防因子的种类
• 1.1 生防细菌的应用
• 1.2 生防放线菌的应用
• 1.3 生防真菌的应用
• 2 生防菌控病机理
• 2.1 种群竞争
• 2.2 抗菌、溶菌作用
• 2.3 诱导抗性作用
• 2.4 重寄生作用
• 3 生物防治中存在问题及解决方法
• 4 展望
• 下篇 研究内容
• 第一章 梨轮纹病和炭疽病病菌的PCR检测技术研究
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株及梨品种
• 1.2 病原菌基因组DNA的提取
• 1.3 特异性引物的设计
• 1.4 常规PCR反应
• 1.5 巢式PCR反应
• 2 结果与分析
• 2.1 不同浓度炭疽病菌孢子液对梨果的致病力
• 2.2 引物LW1/LW2特异性PCR扩增
• 2.3 引物TJ1/TJ2的特异性PCR扩增
• 2.4 巢式PCR和常规PCR扩增梨轮纹病菌菌株基因组DNA灵敏度比较
• 2.5 接种梨病组织的PCR快速检测
• 2.6 喷施轮纹菌孢子液的梨果的检测
• 2.7 喷施炭疽菌孢子液的梨果的检测
• 3 讨论
• 第二章 梨黑斑病菌、轮纹病菌、炭疽病菌对常见20种化学药剂的抗药性风险评价
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 常见化学药剂对梨黑斑病菌的毒力测定
• 2.2 常见化学药剂对梨轮纹病菌的毒力测定
• 2.3 常见化学药剂对梨炭疽病菌的毒力测定
• 3 讨论
• 第三章 生物化学复配剂对梨黑斑病、轮纹病、炭疽病的田间防效
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 三种药剂处理对梨黑斑病的控制效果
• 2.2 三种药剂处理对梨轮纹病的控制效果
• 2.3 三种药剂处理对梨炭疽病的控制效果
• 3 讨论
• 第四章 生防菌sf-628对梨叶片苯丙氨酸解氨酶和过氧化氢酶基因表达的影响
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 材料和方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.3 样品处理
• 1.4 引物设计
• 1.5 梨叶片RNA的提取
• 1.6 实时荧光定量PCR
• 1.7 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 PAL相对表达量分析
• 2.2 CAT相对表达量分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 本论文创新点
• 已发表论文
• 致谢