玉米S-CMS育性相关基因片段orf77、orf17的转基因验证

论文摘要

玉米是三种主要农作物之一,研究玉米细胞质雄性不育具有重要的意义。将玉米S-CMS育性相关基因orf77及orf77的体外定点诱变产物ofr17分别转入到玉米、水稻、拟南芥中,所用质粒载体是pCAMBIA1303,在orf77、orf17的前面连上一段线粒体靶向序列（ATP synthase subunit beta的前导序列）,将合成的蛋白导入到线粒体,所用的启动子是玉米中的zm13花粉特异性的启动子。采用基因枪和农杆菌浸染两种方法分别转化玉米,潮霉素筛选压为25mg/L,农杆菌菌株是LBA4404。使用农杆菌浸染法转化水稻,所用农杆菌菌株是EHA105,潮霉素筛选压是50mg/L。拟南芥采用农杆菌花序浸染法,所用农杆菌菌株是GV3101,潮霉素筛选压是50mg/L。玉米转化未得到成活的阳性转基因苗,分析原因可能是筛选标记潮霉素对玉米进行筛选效果不显著;受体材料质量不佳,愈伤组织分化率低,转化率低。水稻和拟南芥的转化中均得到了转基因植株。T0代的水稻和拟南芥中,花粉的育性受到了影响,导致了花粉的部分不育,可能是orf77、orf17的转入导致的,但也可能是转基因和组培过程所导致的。T1代的水稻和拟南芥中,orf77、orf17基因都发生了分离,但不论有无orf77、orf17的存在,T1代花粉的育性全部都表现正常,没有导致雄性不育。从转录水平上检测orf77、orf17是否发生转录,结果表明orf77、orf17在花粉内均进行了转录。DNA水平上检测orf77、orf17已转入,RNA水平上检测orf77、orf17也发生转录,但转基因水稻和拟南芥的育性却不受影响,分析原因可能是:orf77是玉米的雄性不育基因,orf17是玉米雄性不育基因orf77的编辑产物,由于物种间的差异,orf77、orf17可能不能导致转基因水稻、拟南芥的雄性不育;ORF77、ORF17蛋白的表达量不够,不能够导致转基因植株的雄性不育;线粒体靶向序列可能存在问题,未能将ORF77、ORF17蛋白导入线粒体,所以不能发挥功能;ORF77、ORF17蛋白的表达时期也是原因之一,在花粉期的不同阶段也会影响ORF77、ORF17蛋白功能的发挥,不能引起雄性不育。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 1 前言
• 1.1 细胞质雄性不育的研究意义
• 1.1.1 细胞质雄性不育的利用有利于促进杂种优势的有效利用
• 1.1.2 细胞质雄性不育的利用有利于提高种子纯度
• 1.2 雄性不育的概念
• 1.3 玉米中常见的几种雄性不育细胞质
• 1.3.1 恢复专效性分类
• 1.3.2 分子生物学分类
• 1.4 平米CMS胞质育性相关基因研究
• 1.4.1 不育基因位点及机理研究
• 1.4.2 恢复机理研究
• 1.4.3 雄性不育性恢复机理的假说
• 1.4.3.1 代谢与互作假说
• 1.4.4.2 抑制细胞程序性死亡（Program Cell Death.PCD）假说
• 1.4.4.3 RNA加工假说
• 1.5 植物转基因研究进展
• 1.5.1 常用的植物转基因方法、原理
• 1.5.2 基因枪转化法
• 1.5.3 农杆菌介导转化法
• 1.5.4 花粉管通道法
• 1.5.5 化学物质诱导法
• 1.5.6 电激穿孔法
• 1.5.7 脂质体法
• 1.5.8 其他方法
• 1.6 细胞核与线粒体蛋白质
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 实验材料及方法
• 2.1 研究材料及试剂
• 2.1.1 植物材料和所用质粒、菌株
• 2.1.2 用于遗传转化的基因片段
• 2.1.3 各种酶及试剂
• 2.1.4 本实验所用到的引物
• 2.2 载体改造方法
• 2.2.1 载体改造路线
• 2.2.2 花粉特异性启动子序列的克隆
• 2.2.2.1 植物材料中总DNA的抽提
• 2.2.2.2 zm13启动子的扩增
• 2.2.2.3 电转化感受态的制备
• 2.2.2.4 PCR产物连接
• 2.2.2.5 连接产物的转化
• 2.2.2.6 阳性克隆的筛选
• 2.2.3 pZM13中间载体的构建
• 2.2.3.1 DNA酶切
• 2.2.3.2 两回收片段的连接及转化
• 2.2.3.3 阳性克隆的筛选及测序
• 2.2.4 线粒体靶向序列的克隆
• 2.2.5 orf77的克隆
• 2.2.6 orf17的定点诱变
• 2.2.7 pLP77、pLP17中间载体的构建
• 2.2.7.1 DNA酶切
• 2.2.7.2 回收片段的连接及转化
• 2.2.7.3 阳性克隆的筛选及测序
• 2.2.8 最终载体pZMLP77和pZMLP17的构建
• 2.2.8.1 双酶切两中间载体
• 2.2.8.2 回收片段的连接、转化
• 2.2.8.3 阳性克隆的筛选及测序
• 2.3 农杆菌介导的遗传转化法转化玉米18-599W、18-599R
• 2.3.1 农杆菌菌株的准备
• 2.3.2 幼胚胚性愈伤组织的诱导与继代
• 2.3.3 米农杆菌浸染过程
• 2.3.3.1 农杆菌侵染液的准备
• 2.3.3.2 抗性愈伤的筛选及再生
• 2.4 基因枪转化转化玉米18-599W、18-599R
• 2.4.1 转化受体的准备
• 2.4.2 微弹制备
• 2.4.3 基因枪准备及轰击
• 2.4.4 抗性愈伤的筛选及再生
• 2.5 农杆菌介导的遗传转化法转化水稻牡丹江8号
• 2.5.1 农杆菌菌株的准备
• 2.5.2 农杆菌介导的遗传转化法转化水稻
• 2.6 花序浸染法转化拟南芥
• 2.6.1 农杆菌菌株的准备
• 2.6.2 农杆菌介导的遗传转化法转化拟南芥花序
• 2.7 转基因植株的PCR检测
• 2.8 基因的表达分析
• 2.8.1 RNA的抽提及检测
• 2.8.2 RT-PCR
• 3 结果与分析
• 3.1 各基因片段的准备
• 3.1.1 基因orf77的克隆
• 3.1.2 基因orf17的体外定点诱变
• 3.1.3 花粉特异性启动子zm13的克隆
• 3.1.4 线粒体靶向序列的全基因合成
• 3.2 载体的构建
• 3.2.1 中间载体pLP77、pLP17的酶切检测
• 3.2.2 中间载体pZM1303的酶切检测
• 3.3 玉米转化的结果与分析
• 3.4 水稻转化的结果与分析
• 3.4.1 T0代转基因水稻的PCR检测
• 3.4.2 T1代转基因水稻的PCR检测
• 3.4.3 T1代转基因水稻的转录水平检测
• 3.4.4 T0代转基因水稻的花粉育性检测
• 3.4.5 T1代转基因水稻的花粉育性检测
• 3.5 拟南芥转化的结果与分析
• 3.5.1 T0代转基因拟南芥的PCR检测
• 3.5.2 T1代转基因拟南芥的PCR检测
• 3.5.3 T0代转基因拟南芥的花粉育性观察
• 3.5.4 T1代转基因拟南芥的花粉育性观察
• 4 讨论
• 4.1 育性相关的候选基因orf77、orf17
• 4.2 载体构建的讨论
• 4.2.1 线粒体靶向序列
• 4.2.2 花粉特异性启动子
• 4.3 orf77、orf17对植株育性的影响
• 4.4 玉米的转化改进
• 4.5 下一步工作计划
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 常用培养基和溶液的配制
• 附录2 提取质粒（小样法）
• 附录3 凝胶回收DNA片段（TAKARA）
• 附录4 电转化感受态的制备
• 附录5 电转化
• 附录6 物总DNA的小量提取（CTAB法）
• 附录7 植物总DNA的大量提取（CTAB法）
• 附录8 总RNA的提取
• 附录9 大样法抽提高浓度质粒
• 附录10 基因枪使用方法
• 附录11 玉米组培培养基
• 附录12 农杆菌法转化玉米所用培养基
• 附录13 基因枪法转化玉米所用培养基
• 附录14 水稻遗传转化培养基
• 附录15 玉米育性相关线粒体基因orf77编码序列
• 附录16 F-1-ATPase subunit 2的前导肽序列
• 附录17 F-1-ATPase subunit 2的氨基酸序列
• 附录18 花粉特异性启动子zm13序列