化学修饰肝素抑制P-选择素介导的乳腺癌细胞粘附作用分子机制的研究

论文摘要

选择素（selectin）是细胞粘附分子的一个家族,其主要功能是在炎症发生,免疫应答和组织损伤修复过程中介导白细胞与血管内皮细胞,以及介导白细胞之间、白细胞与血小板之间的粘附。近年来,有大量的证据表明,选择素在肿瘤转移的过程中介导经血液转移的肿瘤细胞与血小板及血管内皮细胞的粘附。在此过程中,肿瘤细胞与血小板及血管内皮细胞间的相互作用是肿瘤成功转移的一个非常关键的环节。众所周知,肿瘤转移是一个多步骤、多阶段、多因子参与的复杂过程,多种细胞粘附分子发挥着重要作用,如选择素分子和整合素分子等。对于整个转移进程而言,与其它粘附分子相比,选择素在肿瘤黏附的起始阶段起着关键的作用。在选择素家族中,P-选择素在介导多种肿瘤细胞与血小板,肿瘤细胞与内皮细胞间的粘附起了非常重要的作用。因此,干扰P-选择素和其配体的相互作用在一定程度上可以削弱肿瘤细胞的转移能力,所以抑制肿瘤细胞与P-选择素的结合是肿瘤转移治疗中的一个潜在靶点。P-选择素通过与其相应的配体结合,发挥它的作用。就目前所知,几乎所有的选择素的高亲和性的配体都具有特定的糖链结构,包括路易斯寡糖（Lewistetrasaccharide）,PSGL-1（P-selectin glycoprotein ligand-1）,硫酸乙酰肝素（Heparansulfate,HS）,硫酸软骨素（Chondroitin sulfate）以及硫酸化的糖蛋白或糖脂。人们针对P-选择素的相关配体,设计了包括抗体、配体的类似物和模拟物在内的P-选择素拮抗剂,其中肝素类分子在体外和体内的研究中都证明能够抑制P-选择素所介导的多种肿瘤细胞的粘附。但其分子机理还不清楚,许多问题有待于进一步阐述。肝素是一种糖胺聚糖,是临床上广泛应用的抗凝血药物,其抗凝血活性带来的潜在出血并发症危险限制了其在预防和治疗肿瘤转移方面的应用。为此,人们利用化学修饰方法,制备了多种具有低抗凝血活性的肝素修饰物,这些肝素修饰物不但具有抗肿瘤增殖和转移的作用,而且其抗凝血不良反应小。尽管目前肝素修饰物抑制肿瘤转移的机制不十分清楚,但是从临床和动物实验中所得的结果来看,具有低抗凝血活性的肝素修物在预防和治疗肿瘤转移方面还是一类很有潜力的治疗试剂。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,并且发病率每年约以2%的速度递增,侵袭转移是影响乳腺癌预后最重要的因素。已有的研究表明,P-选择素能够与人乳腺癌细胞结合,但具有低抗凝血活性的化学修饰肝素是否能够抑制P-选择素与人乳腺癌细胞的相互作用及人乳腺癌细胞表达的P-选择素的配体类型有待进一步的分析。本研究中,我们利用化学修饰方法,制备了四种具有低抗凝血活性的肝素修饰物（RO-Heparin、CR-Heparin、2/3ODS-Heparin和N/2/3DS-Heparin）。选取了人乳腺癌细胞ZR-75-30,系统地分析了这种肿瘤细胞系与P-选择素、转染P-选择素的CHO细胞和血小板在静止和流动状态下的相互作用以及肝素和肝素修饰物对这种相互作用的抑制。结果表明,人乳腺癌细胞ZR-75-30能够与P-选择素在静止和层流条件下结合,肝素以及化学肝素修饰物可以显著的抑制瘤细胞与P-选择素、转染P-选择素的CHO细胞以及血小板间的粘附。为了进一步分析化学修饰肝素抑制人乳腺癌细胞与P-选择素相互作用的机制,我们通过特异性的单克隆抗体标记、肝素酶处理肿瘤细胞和流式细胞仪分析,证明人乳腺癌细胞ZR-75-30高表达硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,但是肝素酶处理不影响P-选择素与人乳腺癌细胞ZR-75-30的结合,说明这种人乳腺癌细胞ZR-75-30表面的P-选择素配体不具有类硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结构。为了进一步分析人乳腺癌细胞ZR-75-30表达的P-选择素配体类型,利用唾液酸酶和胰蛋白酶处理实验,证明人乳腺癌细胞ZR-75-30表达的P-选择素配体类型主要是非唾液酸化糖蛋白。通过细胞内分子硫酸化抑制实验,证明细胞膜蛋白分子硫酸根的含量影响P-选择素与人乳腺癌细胞ZR-75-30的相互作用。鉴于本实验中所制备的肝素修饰物与肝素对照相比,有不同程度的去硫酸化修饰。肝素修饰物硫酸化的程度与其抑制P-选择素与人乳腺癌细胞ZR-75-30的结合呈正相关。关于化学修饰肝素在抑制P-选择素介导的人乳腺癌转移中是否有更广泛的应用,有待进一步的研究。我们的实验结果表明,本研究中所制备的四种肝素修饰物（RO-Heparin、CR-Heparin、2/3ODS-Heparin和N/2/3DS-Heparin）能够抑制P-选择素所介导的人乳腺癌细胞与P-选择素的的粘附,而且P-选择素配体不具有类硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结构。我们的研究为肝素修饰物应用于抑制乳腺癌转移的治疗提供了很好的靶点,同时也为进一步解析P-选择素与其配体相互作用的机制提供了新的线索。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 前言
• 一、选择素概述
• （一） 选择素家族的组成、结构及分布
• （二） 选择素的配体
• （三） 选择素的生理功能
• （四） 选择素在乳腺癌中的研究现状
• 二、肝素及肝素修饰物概述
• （一） 肝素的结构
• （二） 肝素的功能
• （三） 肝素修饰物的制备方法
• （四） 肝素修饰物在肿瘤转移中的研究现状
• 三、本论文的研究内容和意义
• 材料与方法
• 一、实验材料
• （一） 菌株和细胞系
• （二） 蛋白质、抗体及质粒
• （三） 试剂
• （四） 主要仪器及设备
• 二、实验方法
• （一） 细胞培养
• （二） 质粒的大量制备
• （三） CHO细胞的瞬时转染
• （四） 化学肝素修饰物的制备及结构活性分析
• （五） 免疫荧光检测
• （六） 细胞内分子硫酸化抑制实验
• （七） 肿瘤细胞的酶处理实验
• （八） 流式细胞仪分析
• （九） 血小板的固定
• （十） 体外模拟毛细血管的层流实验
• （十一） 统计分析
• 结果与分析
• 一、肝素修饰物的制备及活性分析
• （一） 结构完整性分析
• （二） 硫酸根含量的测定
• （三） 抗凝血活性的测定
• 二、肝素修饰物对 P-选择素介导的乳腺癌细胞粘附作用的影响
• （一） P-选择素与乳腺癌细胞在静止状态下的粘附
• （二） 肝素修饰物抑制P-选择素与乳腺癌细胞在静止状态下的粘附
• （三） 肝素修饰物抑制P-选择素与乳腺癌细胞在层流状态下的粘附
• 三、在静止条件下，糖蛋白对 P-选择素介导的乳腺癌细胞粘附作用的影响
• 讨论
• 一、人乳腺癌细胞表达多种类型的P-选择素的配体
• 二、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在肿瘤转移过程中的作用
• 三、肝素通过多种机制抑制 P-选择素与肿瘤细胞的粘附
• 四、化学修饰肝素作为抗肿瘤转移药物的应用前景
• 结论
• 本研究主要创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历