猪GPR6基因的克隆与表达分析

论文摘要

GPR6是G蛋白偶联受体家族成员之一。研究表明,GPR6对卵母细胞减数分裂前期Ⅰ阻滞有重要作用。对GPR6基因的克隆测序及初步分析,可为研究猪GPR6基因的生物学功能和品种改良提供基础的基因信息。本文采用同源序列比对的方法,结合RT-PCR和RACE技术,获得了猪GPR6基因的cDNA序列。利用生物信息学方法预测了猪GPR6蛋白的结构和功能,并进行了同源序列多重比对和分子系统发生分析。利用实时荧光定量PCR （Real-time PCR）技术分别分析了GPR6基因在商品猪不同组织、不同生长发育时期商品猪卵巢、不同品种（杂交组合）猪卵巢及商品猪不同发育时期卵泡内的表达水平。同时进行了原核表达的研究。1GPR6基因的克隆测序分别用人和小鼠等GPR6基因的核苷酸序列进行同源序列比对,基于此序列设计引物,扩增ORF区；根据测序结果设计3’RACE引物,获得猪GPR6基因的cDNA序列,长度为1664bp, GenBank登录号为HM777010.2GPR6蛋白的生物信息学分析借助生物信息学网络资源和软件,预测猪GPR6基因开放阅读框的长度为1101bp,编码366个氨基酸残基,且两侧分别是52bp的5’UTR和512bp的3’UTR。通过对蛋白序列相似性检索,预测出猪GPR6蛋白不含有信号肽,有7个跨膜区,有明显的疏水区。3Real-time PCR分析猪GPR6mRNA的表达采用实时荧光定量PCR技术,分别分析了GPR6在商品猪不同组织、不同生长时期商品猪卵巢、不同猪种卵巢及不同生长时期卵泡内的表达水平。结果表明：GPR6基因在商品猪的不同组织中均有表达,在下丘脑、肝脏中表达量较高,在输卵管、肌肉组织中表达水平较低。GPR6基因在5月龄和6月龄商品猪卵巢中的表达量显著高于其他生长时期（P<0.01）。GPR6mRNA在不同品种猪卵巢中的表达无显著差异。大卵泡中GPR6基因的表达量显著高于中卵泡和小卵泡（P<0.01）。4猪GPR6的原核表达将获得的GPR6基因克隆入原核表达载体pET32a（+）中,组装成原核表达载体pET32a（+）-GPR6,经测序表明其阅读框正确。将这个表达载体转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中,IPTG诱导培养后,经SDS-PAGE检查可知特异性表达带的位置。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 G蛋白偶联受体研究进展
• 第二篇 实验研究
• 第二章 猪GPR6基因的克隆测序与生物信息学分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 猪GPR6的ORF区扩增
• 2.2 3’UTR扩增
• 2.3 PCR产物克隆测序
• 2.4 生物信息学分析
• 3 讨论
• 3.1 RACE技术的优缺点
• 3.2 如何有效降低单侧引物扩增的影响
• 3.3 TA克隆技术
• 3.4 猪GPR6基因的生物信息学分析
• 4 小结
• 第三章 猪GPR6基因的表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 猪GPR6基因在各组织中的扩增结果
• 2.2 GPR6基因在不同组织中的表达分析
• 2.3 GPR6基因在猪不同时期卵巢中的表达分析
• 2.4 GPR6基因在不同猪种卵巢中的表达分析
• 2.5 GPR6基因在大、中和小卵泡中的表达分析
• 3 讨论
• 第四章 猪GPR6基因在大肠杆菌中的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要溶液及其配制
• 1.5 软件预测猪GPR6蛋白抗原决定簇
• 1.6 猪GPR6基因原核表达载体的构建与鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 猪GPR6蛋白抗原决定簇预测结果
• 2.2 猪GPR6基因表达序列的扩增
• 2.3 构建原核表达载体pET32a-GPR6
• 2.4 重组质粒的鉴定
• 2.5 重组质粒诱导表达的SDS-PAGE分析
• 3 讨论
• 3.1 表达系统的选择
• 3.2 pET-32a（+）-GPR6原核表达载体的构建
• 3.3 大肠杆菌表达条件的优化
• 4 小结
• 参考文献
• 全文结论
• 附录
• 致谢