论文摘要
在前期的研究中,实验室以多年鉴定为高抗白粉病的中国野生华东葡萄白河-35-1为材料,采用Clontech SMART试剂盒构建了cDNA文库。在此基础上,采用抗病基因同源序列法进行克隆与分析,取得的主要研究结果如下:1.根据噬菌体在寄主大肠杆菌中能利用重组酶自身环化成质粒这一原理,将cDNA文库中的噬菌体环化成质粒,形成质粒文库。通过cDNA文库梯度稀释试验,确立了E.coli BM25.8与cDNA原始文库的最佳混合比例为200μL感受态BM25.8应与小于≤104 pfu的文库混合,才可获得分离良好且菌落数量满足筛选要求的环化cDNA文库。2.根据抗病基因蛋白质N、L6、RPS2上的位于P-环(P-Loop)上的GVGKTT氨基酸保守结构域设计简并PCR引物,对环化cDNA文库中的菌落进行PCR筛选,对阳性菌落的质粒进一步提取质粒进行PCR检测,最后对阳性质粒测序,获得了抗病相关cDNA片段36个。3.用Blast软件对葡萄植物36个抗病基因同源类似物(RGA)核苷酸序列进行分析,发现测得的序列中,大多数为未知基因序列,利用DNAstar软件中的ClustalW程序进行多序列比对,将所有序列分为2大类:一类是抗性相关基因,有些与已登陆葡萄抗白粉病基因序列相似,有些与水分胁迫表达基因相似,有些和葡萄抗皮尔斯病基因高度同源;另一类是与果实发育有关的基因,包括07-No.239、No.80、No.235、No.160、No.100、No.76、No.391、No.190、No.241、No.155、No.178、No.238。其中抗性相关基因根据功能是否已知分为已知功能抗性基因和功能未知的抗性基因。
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