PCR技术用于啤酒中有害乳酸菌的检测和鉴定的研究

论文摘要

乳酸菌是造成啤酒腐败的最常见微生物,对啤酒的危害很大。而纯生啤酒的厌氧菌污染危害更大,会使其质量在短时间内发生改变。目前常用的啤酒有害菌检测方法是厌氧平板培养法,即待长出菌落后通过菌落形态、细胞形态、革兰氏染色、过氧化氢酶阳性以及一系列生理生化实验来鉴定这些腐败菌。这种方法最大的缺陷是费时, 5～7d才可看到结果,不能够及时反馈微生物的污染状况。现代啤酒工业非常需要一种快速微生物检测技术,以解决传统微生物检测结果大大滞后于工艺生产的尴尬状况。PCR技术应用于啤酒厌氧菌的鉴定,不仅快速、准确,而且可以预测污染菌对啤酒的腐败能力,及时为生产提供指导性信息,具有一定的推广价值。PCR技术在快速鉴定啤酒污染菌中的应用,需要对样品中的菌体细胞进行增殖培养以提高检测的灵敏度,为此,本课题比较了目前广泛用于啤酒有害菌检测的选择性培养基对啤酒有害菌检出的效果和菌体在培养基上的生长速度,为啤酒污染乳酸菌选择合适的富集培养基。本文比较了短乳杆菌、林氏乳杆菌、布氏乳杆菌、植物乳杆菌和四联球菌在NBB、MRS和自制UBA培养基上的菌落生量。同时比较了几种DNA提取的方法的提取效果。根据乳酸菌16s rDNA序列的特征,设计合成了针对啤酒有害乳酸菌的通用引物,同时根据乳酸菌16s rDNA序列的高变区设计了5种乳酸菌的特征引物,PCR技术验证结果表明该5种引物能够准确鉴定乳酸菌。在以上研究的基础上,本文建立了PCR快速检测啤酒有害菌的新方法,用基于16s rDNA部分序列的特征引物对啤酒污染乳酸菌进行PCR检测,灵敏度可达到15个细胞(CFU)/250mL,样品的预培养需12～18h。啤酒有害菌检测所需时间从传统的5d减少到24h。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 啤酒酿造中污染微生物的种类和对啤酒的危害
• 1.2 传统方法在微生物多样性研究中的应用
• 1.3 分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用
• 1.4 啤酒中微生物的检测
• 1.4.1 检测啤酒中微生物的传统方法
• 1.4.2 啤酒中微生物的分子检测技术
• 1.5 复杂样品中微生物总DNA 的提取
• 1.6 本论文的研究目的、意义和内容
• 1.6.1 研究的目的和意义
• 1.6.2 主要研究内容
• 2 啤酒有害菌富集培养基的选择
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 三种固体培养基对乳酸杆菌检测效果的比较
• 2.2.2 三种固体培养基对片球菌检测效果的比较
• 2.2.3 三种液体培养基对乳酸杆菌富集效果的比较
• 2.2.4 三种液体培养基对片球菌富集效果的比较
• 2.3 结论
• 3 啤酒中乳酸菌DNA 提取方法的比较
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.3 结论
• 4 啤酒中污染乳酸菌通用引物和五种常见有害乳酸菌特征引物的设计
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 啤酒中污染乳酸菌的种群进化关系
• 4.2.2 啤酒中污染乳酸菌16s rDNA同源序列
• 4.2.3 啤酒中污染乳酸菌通用引物的选择
• 4.2.4 啤酒中五种常见有害乳酸菌特征引物的选择
• 4.3 结论
• 5 引物的验证
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 通用引物的验证结果分析
• 5.2.2 特征引物的验证结果分析
• 5.3 结论
• 6 引物LAB1/LAB2 用于PCR 检测啤酒中乳酸菌灵敏度的确定
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 试验材料
• 6.1.2 试验方法
• 6.2 结果与分析
• 6.3 结论
• 7 结论与展望
• 7.1 本文主要结论
• 7.2 问题与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录（一）
• 附录（二）
• 作者简介