养殖真鲷、黑鲷抗菌肽hepcidin的基因克隆、表达特性及其抗菌活性研究

论文摘要

抗菌肽（antimicrobial peptide）是一类具有广谱抗微生物活性的天然小肽类物质,是先天免疫系统中重要的非特异性免疫因子。Hepcidin是2000年首先从人类中发现的一类富含半胱氨酸、性质独特的抗菌肽,其不仅具有显著的抗微生物活性,还被认为是一种关键的铁代谢调节因子,在鱼类中分布广泛。本论文以我国重要的海水经济养殖鱼类-真鲷（Pagrus major）和黑鲷（ Spagrus macrocephalus）为研究对象,较深入的研究了hepcidin抗菌肽的基因结构组成、器官、组织特异性分布、体外表达及其表达产物的抗菌活性,为开发应用hepcidin抗菌肽奠定基础。通过研究获得了如下结果:1构建了真鲷鳃cDNA文库。以细菌攻毒的真鲷鳃为材料,提取并分离出mRNA,合成双链后,回收500bp～4,000bp cDNA片段,构建了λZAP表达型cDNA文库。初级文库的容量为1.75×105个重组子,扩增文库的滴度达到1×109pfu/mL,随机挑选重组克隆的插入片段在500～2000bp之间。根据已发表的hepcidin序列的保守区域设计特异性引物,以此引物做PCR扩增文库,获得了hepcidin抗菌肽基因cDNA片段（GenBank登录号为AY574220）。该cDNA文库的构建为分离和筛选抗菌肽及其它免疫相关基因奠定基础。2克隆获得了真鲷、黑鲷hepcidin基因与基因不同变体cDNA序列。利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和cDNA末端快速扩增技术（RACE）从细菌感染后采集的养殖真鲷肝脏和鳃分离到2条hepcidin cDNA序列（GenBank登录号为AY557619、AY669383）,从黑鲷的肝脏、脾脏、肾脏、鳃、皮肤和血液中分离出7条hepdidin cDNA序列（GenBank登录号为AY669376～82）,每条cDNA序列均包含完整的hepcidin编码区及5′和3′非编码区,并且序列末端均具有明显的多腺苷酸化加尾信号。从推导的真鲷、黑鲷hepcidin氨基酸序列（84～95aa）,发现它们都由信号肽、优势域（prodomain）和成熟肽三部分组成,都具有hepcidin典型的富含半胱氨酸的特点,在信号肽区域和成熟肽8个半胱氨酸的保守位点与已经发表的鱼类hepcidin具有较高的相似性。因此认为从真鲷、黑鲷不同器官、组织中分离到的9个hepcidin变体为hepcidin抗菌肽基因家族的新成员,广泛存在于真鲷和黑鲷的多种器官、组织中。

论文目录

• 缩略语中英文对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 绪论
• 第一节 海洋鱼类抗菌肽研究进展
• 第二节 Hepcidin研究进展
• 第三节 本研究的技术路线、目的和意义
• 第二章 真鲷鳃cDNA文库的构建及hepcidin基因的扩增
• 第一节 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 第二节 结果
• 2.1 总RNA的提取和Poly（A） mRNA分离
• 2.2 消化后的双链DNA
• 2.3 文库滴度和容量测定
• 2.4 cDNA文库插入片段的随机测定
• 2.5 hepcidin基因的扩增及序列分析
• 第三节 讨论
• 第三章 养殖真鲷、黑鲷不同器官、组织hepcidin 基因的克隆与序列分析
• 第一节 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 第二节 结果
• 2.1 总RNA提取
• 2.2 RT-PCR结果
• 2.3 真鲷3′RACE和5′RACE结果
• 2.4 黑鲷3′RACE 结果
• 2.5 真鲷、黑鲷多器官、组织扩增的hepcidin cDNA 推导的氨基酸序列分析
• 2.6 推导的真鲷、黑鲷hepcidin氨基酸序列与其它已知hepcidin的比较
• 第三节 讨论
• 3.1 RACE技术的应用
• 3.2 推导的真鲷、黑鲷氨基酸序列
• 3.3 真鲷、黑鲷多条hepcidin 序列的获得
• 3.4 hepcidin 的功能
• 第四章 真鲷、黑鲷hepcidin基因组DNA扩增及上游调控元件分析
• 第一节 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 第二节 结果
• 2.1 基因组提取及hepcidin DNA片段的扩增
• 2.2 真鲷基因组hepcidin 上下游片段的扩增及序列分析
• 2.3 黑鲷基因组hepcidin 侧翼片段的扩增及序列分析
• 第三节 讨论
• 3.1 连接头特异扩增及反向PCR 扩增的应用
• 3.2 基因变体对应的多条hepcidin DNA 序列的获得
• 3.3 上游调控序列的分析
• 第五章 hepcidin基因和基因变体在黑鲷不同发育阶段及诱导条件下多器官、组织中的表达特性
• 第一节 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 第二节 结果
• 2.1 总RNA提取
• 2.2 杂交用探针长度及杂交温度
• 2.3 探针浓度的测定
• 2.4 RT-PCR 检测黑鲷幼鱼多器官、组织中hepcidin 的表达
• 2.5 斑点杂交检测黑鲷幼鱼和成鱼多器官、组织中hepcidin 的表达
• 2.6 细菌感染后黑鲷幼鱼多器官、组织中hepcidin 的表达
• 2.7 右旋糖酐铁注射黑鲷幼鱼多器官、组织中hepcidin 的表达
• 第三节 讨论
• 3.1 Dot-blot 与 Northern-blot
• 3.2 hepcidin 的器官、组织特异性表达
• 3.3 细菌感染和铁过量对hepcidin 的诱导
• 第六章 hepcidin 的原核表达、抗菌活性测定及抗体制备
• 第一节 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 第二节 结果
• 2.1 预连接pTrc-CKS 表达载体和hepcidin2 目的cDNA 片段的制备
• 2.2 pTrc-CKS/hepcidin2 表达载体的鉴定及测序
• 2.3 pTrc-CKS/hepcidin2 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.4 hepcidin2 融合表达产物的纯化及 Western-blot 鉴定
• 2.5 纯化表达产物的脱盐及酶切
• 2.6 hepcidin 原核表达蛋白抗菌活性的测定
• 2.7 表达蛋白抗血清效价的测定
• 第三节 讨论
• 3.1 pTrc-CKS 融合表达载体的选择
• 3.2 hepcidin 融合表达产物的诱导及纯化
• 3.3 hepcidin 抗菌活性的相关研究
• 3.4 hepcidin 体外表达的相关研究
• 结语
• 参考文献
• 在学期间参加的科研项目及成果
• 致谢