论文摘要
摩氏摩根菌是革兰阴性菌,属肠杆菌科,有3个亚种,M. morganii、M. sibonii.和Morganella psychrotolerans,存在于环境中,以及人类、爬行动物和哺乳动物的肠道内。摩氏摩根菌是引发院内感染的重要病原菌之一。噬菌体作为细菌的病毒,是微生物中的非细胞形态的低级生命形式,它在自然界中广泛存在,是生物圈中数量最多的生命形式。本实验室已完成摩氏摩根菌噬菌体MmP1的全基因组测序及初步的基因组注释,并已在GenBank上登录（No. EU652770）。噬菌体是以细菌为宿主的病毒,能够特异性的感染和裂解细菌。噬菌体感染宿主菌时,要穿过细菌细胞壁肽聚糖层,或者将其核酸注入到宿主菌体内进行复制。而噬菌体完成复制、组装后,又需破坏宿主菌肽聚糖层,释放子代噬菌体,进行下一步的感染。而控制双链DNA噬菌体进入宿主细胞的物质是一种由噬菌体编码的蛋白,称作内溶素或溶素（Endolysin or Lysin）。内溶素是一种可以破坏宿主菌细胞壁肽聚糖的酶蛋白。因此,在对抗生素耐药性越来越明显的情况下,内溶素有可能成为某些致病细菌的潜在抗感染药物。通过基因预测及BLAST分析,我们推定摩氏摩根菌噬菌体MmP1基因组的ORF12编码内溶素基因。因此本文首先从生物信息学的角度对该基因编码产物的氨基酸序列进行结构分析,随即克隆MmP1内溶素基因,并成功构建了重组质粒,然后表达、纯化得到重组蛋白,进一步分析重组蛋白对底物肽聚糖的降解活性及抑菌作用,通过实验验证了内溶素的基本生物学活性。其研究内容和结果主要有以下几个方面:1.摩氏摩根菌噬菌体MmP1内溶素氨基酸序列与结构的分析:通过BLAST检索获得推定的摩氏摩根菌噬菌体MmP1内溶素的同源蛋白,分子系统发生进化分析提示摩氏摩根菌噬菌体MmP1内溶素与噬菌体K11溶菌酶的进化距离最近,二者可能来源于同一祖先序列;蛋白质结构预测结果显示MmP1内溶素具有与T7酰胺酶相似的二级结构与三级结构,并含有由His17、Tyr46、His122、Lys128及Cys130构成的活性中心,该结果提示MmP1内溶素可能为一种具有N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶活性的锌酰胺酶。2.摩氏摩根菌噬菌体MmP1内溶素全长基因的克隆:通过对PCR反应体系与条件的优化,扩增到了内溶素全长结构基因,并将其插入原核表达载体pQE31中,成功构建了内溶素重组质粒pQE31-M12。该重组质粒经BamHⅠ和sal I双酶切鉴定后,对重组质粒进行核苷酸测序,结果表明重组质粒的序列和阅读框均正确。3.摩氏摩根菌噬菌体MmP1内溶素全长基因的表达与纯化:将重组质粒转化大肠埃希菌JM109,获得了表达稳定的基因工程菌,并优化了表达条件。该表达菌经过超声裂解及SDS-PAGE电泳,确定目的蛋白为分泌型表达,故对融合蛋白上清行非变性的Ni-NTA柱亲和层析以及分子筛层析纯化后,获得单一条带的目的蛋白。Lowry法测定目标蛋白浓度为4.964 mg/ml。4.重组融合蛋白的降解活性测定:提取摩氏摩根菌细胞肽聚糖成分,采用酶谱电泳法、扩散法检测重组融合蛋白（浓度为10mg/ml）对细胞壁肽聚糖层的降解活性,结果显示重组融合蛋白对摩氏摩根菌肽聚糖具有显著降解作用。5.重组融合蛋白抑菌活性研究:通过扩散法,利用重组融合蛋白（浓度为20mg/ml）分别处理革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌）和革兰阴性菌（铜绿假单胞菌和摩氏摩根菌）,结果显示目的蛋白只对金黄色葡萄球菌具有抑制现象,而对革兰阴性菌没有抑制现象;进一步测得重组融合蛋白的MIC值为0.39μg/ml,并将其与三种抗生素（新青Ⅱ、Amp、Car）协同作用,结果提示重组融合蛋白可显著增强这三种抗生素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。综上所述,本研究首先通过序列与结构分析提示摩氏摩根菌噬菌体MmP1内溶素可能为一种具有N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶活性的锌酰胺酶;然后对MmP1内溶素基因进行了克隆和表达,并通过非变性的Ni-NTA柱亲和层析以及分子筛层析,获得了纯化的重组融合蛋白;获得的融合蛋白经体外活性检测证实,对摩氏摩根菌细胞壁肽聚糖具有一定的降解活性,并且对金黄色葡萄球菌活菌具有一定的抑菌活性,并且与新青Ⅱ、Amp、Car等抗生素联合使用具有协同抑菌效果。本研究结果为进一步研究该内溶素的功能、作用机制及其在临床上各种抗感染治疗中的潜在运用奠定了一定的基础。
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