血红素氧化酶-1、血浆铁蛋白水平与2型糖尿病的关联研究

论文摘要

糖尿病（Diabetes Mellitus, DM）是一种常见的营养相关代谢疾病,其中最常见的是2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus, T2DM）,约占糖尿病总人数的90%-95%。在正常糖稳态（Normal glucose homeostasis）和糖尿病之间,存在着一个被称作糖尿病前期（Prediabetes）的中间代谢状态,即糖调节受损（Impaired glucose regulation,IGR）,包括糖耐量受损（Impaired glucose tolerance, IGT）和空腹血糖受损（Impaired fasting glucose, IFG）。IGT与IFG既可以单独出现,也可以同时出现。随着人类社会经济的发展和生活方式的改变,糖尿病的发病率与患病率也不断攀升,已经成为世界范围内威胁人类健康与发展的重大公共卫生问题。根据国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation, IDF）最新的数据显示,2010年全球糖尿病患病人数约为2.85亿,占20-79岁成人的6.6%,其导致的疾病负担约为3760亿美元,占2010年总卫生支出的11.6%；预计到2030年,全球糖尿病患病人数约为4.38亿,占20-79岁成人的7.8%,其导致的疾病负担将高达为4900亿美元。在中国,2007-2008年中华医学会糖尿病学分会组织全国糖尿病调查结果显示,我国20岁以上人群中糖尿病患病率为9.7%,总患病人数约为9240万；IGR患病率高达15.5%,总患病人数高达1.482亿。T2DM的发病机制十分复杂,至今仍不完全清楚。已有研究表明,高血糖和游离脂肪酸所致的氧化应激（Oxidative stress）是造成胰岛素抵抗和胰岛β细胞损伤共同的早期病理机制,在T2DM的发生和发展过程中起着重要的作用。本课题组前期开展的分子流行病学调查也发现,新诊断的糖尿病患者血浆中MDA含量升高、总抗氧化能力降低、红细胞SOD活性降低,而且还存在着轻微的DNA氧化损伤。Tiedge等甚至还发现,在高葡萄糖暴露的刺激下,可以诱导胰岛产生氧化应激,但是在SOD、CAT、GPx等经典的抗氧化酶的表达水平出现显著增加之前,血红素氧化酶-1（Heme oxygenase-1, HO-1）的表达水平就已经显著增高了,这提示HO-1可能是胰岛细胞受到氧化损伤的一个早期生物标志物。HO-1是血红素降解的限速酶,催化血红素生成胆绿素（Biliverdin）、一氧化碳和铁。胆绿素在胆绿素还原酶的作用下很快生成胆红素（Bilirubin）。近年来有研究表明,HO-1作为生物体内一种重要的应激反应蛋白（Stress-responsive protein）,广泛参与氧化应激、炎症、凋亡等病理生理过程,并被认为可能作为抗糖尿病治疗的新的分子靶点。本课题组前期曾采用四氧嘧啶腹腔注射构建Balb/c小鼠糖尿病模型,结果显示,糖尿病小鼠脾细胞内HO-1表达降低,另外我们还发现,糖尿病小鼠肾脏线粒体内的HO-1表达情况与时间有关,注射四氧嘧啶4周后HO-1表达升高,而注射四氧嘧啶8周后HO-1表达降低。另一方面,本课题组前期还曾对中国汉族人群中1103名新诊断的糖尿病患者以及1615名正常对照人群进行了HO-1基因多态性分析,结果证实了中国人群HO-1基因5’端区域中存在着GT重复序列微卫星多态性（Microsatellite polymorphism）和T（-413）A单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）,而且还发现,GT重复序列微卫星多态性中的L等位基因（≥25 repeats）是患2型糖尿病的危险等位基因,携带LL基因型的人群中2型糖尿病的发病危险是携带SS基因型的人群的1.37倍。最近有研究表明,血浆或血清中HO-1水平可以被检测得到,并且可能作为反映氧化应激状态的一个新的生物标志物。例如,在矽肺、帕金森症、噬血细胞综合征中已经观察到血浆或血清中HO-1水平的升高,而且这种升高可能与相应部位的组织损伤有关。然而,血浆或血清中HO-1水平与T2DM的关系国内外至今尚未见相关报道。因此,本研究拟在前期研究的基础上,以新诊断的T2DM患者、IGR（即糖尿病前期）人群和NGT对照人群作为研究对象,围绕HO-1与T2DM的关系,集中探讨血浆HO-1水平与T2DM、IGR发病的关系,HO-1基因多态性对血浆HO-1水平、血浆铁蛋白水平的影响,以及血浆中HO-1相关microRNA水平与T2DM的关系。主要内容包括以下三个部分：第一部分血浆HO-1水平与2型糖尿病及糖尿病前期的分子流行病学研究第一节血浆HO-1水平与2型糖尿病的关联研究目的：比较T2DM患者和对照人群血浆样本中HO-1水平的差异,探讨血浆中HO-1水平与糖脂代谢指标的相关性（Correlation）以及其与T2DM的关联性（Association）,为进一步证实血浆HO-1作为T2DM新的生物标志物奠定基础。方法：研究对象主要为2004年12月-2007年11月在华中科技大学同济医院内分泌实验室做口服糖耐量试验（Oral glucose tolerance test, OGTT）的门诊病人和体检中心年龄和性别匹配的正常个体。根据WHO 1999诊断标准,将他们分为T2DM患者组和非糖尿病对照组。采用问卷调查表收集个人人口学资料（性别、年龄、身高、体重等）、健康/疾病史、吸烟、饮酒状况以及糖尿病家族史等信息。收集血样,测定血糖、胰岛素、血脂等,并用ELISA方法检测血浆HO-1水平。结果：（1）新诊断的T2DM患者BMI值、血浆FPG、OGTT2h、TG、TC水平、高血压、饮酒、糖尿病家族史的比例以及HOMA-IR显著高于非糖尿病对照组,而HOMA-beta显著低于非糖尿病对照组。（2）T2DM组人群的血浆HO-1水平较非糖尿病对照人群显著升高（P<0.001）。（3）血浆HO-1的水平与血浆葡萄糖（FPG、OGTT2h）、胰岛素和HOMA指数（HOMA-beta、HOMA-IR）都呈显著相关。（4）随着血浆HO-1水平的升高,T2DM的风险也逐渐增加。按照非糖尿病对照人群血浆HO-1水平进行四分位划分后,血浆HO-1水平居于最高四分位的人群患T2DM的风险较血浆HO-1水平居于最低四分位的人群显著升高,在调整年龄、性别、BMI、糖尿病家族史后,其OR值为8.23 （95% CI 5.55-12.21; P for trend <0.00）。按照年龄（<55、≥55 y）、性别（男、女）、是否超重（BMI<24、≥24 kg/m2）、当前是否吸烟、是否饮酒、是否患有高血压等进行分层分析后,各亚组内血浆HO-1水平与T2DM之间的关联性依然十分显著。结论：新诊断的T2DM患者血浆HO-1水平较非糖尿病对照人群显著升高；血浆HO-1水平和T2DM风险之间存在着很强的关联性,呈现出明显的剂量反应关系,而且这种关联性在调整了已知的T2DM危险因素后仍十分显著。第二节血浆HO-1水平与糖尿病前期的关联研究目的：探讨血浆HO-1水平与IGR（即糖尿病前期）的关系,并采用ROC曲线的方法来评价血浆HO-1浓度对IGR患病的筛检效果。方法：研究对象的招募同第一节。根据WHO 1999诊断标准,将他们分为IGR组（包括IFG和IGT）和NGT对照组。采用问卷调查表收集个人人口学资料（性别、年龄、身高、体重等）、个人健康／疾病史、吸烟、饮酒状况以及DM家族史等信息。收集血样,测定血糖、胰岛素、血脂等,并用ELISA方法检测血浆HO-1、CRP水平。结果：（1）IGR人群的BMI值、血浆FPG、FPI、OGTT2h、TG、CRP水平、高血压患病率、糖尿病家族史的比例以及HOMA-IR显著高于NGT对照人群,而HOMA-beta显著低于NGT对照人群。（2）IGR人群的血浆HO-1水平较NGT对照人群显著升高（P<0.001）。（3）随着血浆HO-1水平的升高,IGR的风险呈逐渐增加的趋势。按照NGT人群血浆HO-1水平进行四分位划分后,血浆HO-1水平居于最高四分位的人群患IGR的风险较血浆HO-1水平居于最低四分位的人群显著升高。调整年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、高血压患病状况、糖尿病家族史后,其OR值为3.39（95% CI 2.08-5.54; P for trend <0.001）;进一步调整TC、TG、HDL-C和CRP等生化检测指标后,其OR值为3.12 （95% CI 1.89-5.16; P for trend <0.001）。（4）将血浆HO-1水平加到一个由经典危险因素构建的模型（包括年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒、是否高血压、是否具有糖尿病家族史、TC、TG、HDL-C和CRP）中之后,AUC值从0.73（95%CI0.70-0.77）增加到0.75（95%CI0.72-0.79）,差异有统计学意义（P=0.010）。结论：IGR人群血浆HO-1水平较NGT对照人群显著升高；血浆HO-1水平和IGR风险之间存在着很强的关联性,呈现出明显的剂量反应关系,而且这种关联性在调整了经典的危险因素、血脂指标和炎症指标后仍十分显著。第二部分HO-1基因多态性、血浆铁蛋白水平与2型糖尿病的关系第一节HO-1基因多态性与T2DM发病风险的Meta分析目的：对当前已有的关于HO-1基因多态性（包括微卫星多态性和SNP）与T2DM发病风险的研究进行了系统评价和Meta分析。方法：对PubMed/MEDLINE、EMBASE和ISI Web of Science数据库进行计算机检索,在纳入文献中抽取关于人群基本特征、等位基因频率和基因型分布等信息。根据异质性分析的结果,选择固定效应模型或随机效应模型来合并统计量（即OR值及其95%置信区间）。分别采用森林图（Forest plots）和漏斗图（Funnel plots）来描述总体效应统计量和出版偏倚。结果：经过初步评价后,共有5篇文献（包括1751名病例和2902名对照）最终被纳入进行汇总分析。Meta分析结果显示,等位基因L是T2DM的危险位点（Risk locus）。在等位基因分布频率比较中,单个L等位基因对应T2DM的OR值为1.12（95%CI 1.02-1.24）,差异有统计学意义（P=0.02）。携带LL基因型的人群,其T2DM发病风险较携带SS基因型的人群显著增加,OR值为1.25（95% CI 1.04-1.50）,差异有统计学意义（P=0.02）。另外,从漏斗图中可以看出,并没有明显的发表偏倚。然而,与GT重复序列微卫星多态性不同的是,T（-413）A SNP的等位基因和基因型频率在T2DM患者、糖调节受损（IGR）和正常对照人群间没有显著差异。结论：携带较长的HO-1基因GT重复序列长度的个体患T2DM的风险显著高于携带较短的HO-1基因GT重复序列长度的个体。T（-413）A SNP则与T2DM之间没有显著的关联性。第二节HO-1基因多态性对血浆HO-1和血浆铁蛋白水平的影响目的：探讨HO-1基因多态性（包括微卫星多态性和SNP）对血浆HO-1和血浆铁蛋白水平的影响。方法：研究对象的招募同第一部分。根据WHO 1999诊断标准,将他们分为T2DM组、IGR组（包括IFG和IGT）和NGT对照组。采用问卷调查表收集研究人群的一般资料。收集血样,分离血浆测定血糖、胰岛素、血脂、HO-1、铁蛋白水平,并分离外周血单核淋巴细胞提取基因组DNA,用于HO-1基因启动子区域GT重复序列微卫星多态性检测和T（-413）A SNP基因型分析。结果：本研究共纳入研究对象1475名,其中包括T2DM患者529名、IGR人群217名、NGT对照人群729名。其人群基本特征与第一部分类似。T2DM患者、IGR人群、NGT对照人群血浆铁蛋白和HO-1水平都呈逐渐递减的趋势,差异具有统计学意义,分别为P<0.0001和P=0.0001。对于GT重复序列微卫星多态性,总体人群的HO-1基因GT重复序列微卫星多态性不同基因型对血浆铁蛋白水平和HO-1水平都具有显著影响,差异具有统计学意义（P值分别为0.0180和0.0052）。在亚组分析中,仅T2DM患者的HO-1基因GT重复序列微卫星多态性不同基因型对血浆HO-1水平显著影响,差异具有统计学意义（P值为0.0048）。对于T（-413）A SNP,无论是在总体人群还是亚组人群分析中,不同基因型（AA、AT、TT）对血浆铁蛋白和HO-1均没有显著影响。结论：HO-1基因GT重复序列微卫星多态性对血浆铁蛋白水平有显著的影响,这可能是通过其对HO-1水平的影响而实现的。T（-413）A SNP对血浆铁蛋白和HO-1水平均没有显著影响。第三部分血浆中HO-1相关microRNA水平与2型糖尿病的关系目的：探讨血浆中HO-1相关microRNA水平与2型糖尿病的关系。方法：研究对象主要为2011年2月-2011年4月在华中科技大学同济医院内分泌实验室做OGTT试验的门诊病人。根据WHO 1999诊断标准,将他们分为T2DM组和非糖尿病对照组。采用问卷调查表收集研究人群的一般资料。分别采用肝素抗凝采样管和EDTA抗凝采样管收集血样,前者分离血浆后用于血糖、胰岛素测定,后者分离血浆后用于提取总RNA（包含nicroRNA）。通过microRNA相关生物信息学数据库的检索以及文献分析,最终确定将hsa-miR-122、hsa-miR-217和hsa-miR-377纳入为候选miRNA。采用基于TaqMan探针法的荧光定量PCR试剂盒进行血浆miRNA的检测,并采用U6 snRNA作为内参对照,对候选niRNA的荧光定量PCR检测结果进行校正（Normalization）处理。结果：本研究共纳入研究对象49名,其中T2DM病例25名、非糖尿病对照24名。其人群基本特征与第一部分类似。U6 snRNA扩增良好,在总体样本中Ct值变异性较小,可以认为其适宜作为血浆miRNA定量的内参对照。在候选的hsa-miR-122也能较好的扩增得到,然而,hsa-miR-217和hsa-miR-377却都没有明显的扩增。T2DM患者血浆hsa-miR-122的水平高于非糖尿病对照人群,差异具有统计学意义（P=0.0406）。结论：T2DM患者的血浆hsa-miR-122水平比非糖尿病对照人群显著升高。本研究的创新之处：1、首次探讨血浆中HO-1水平与T2DM、IGR的关系,并且发现血浆HO-1水平升高与T2DM、IGR风险增加密切相关；2、首次报道血浆中HO-1相关miRNA的水平,并且发现T2DM患者的血浆hsa-miR-122水平比非糖尿病对照人群显著升高；3、比较系统地探讨HO-1基因多态性（包括微卫星多态性和T（-413）A SNP）对血浆HO-1水平和铁蛋白水平的影响,为将来提出个体化的铁蛋白适宜水平提供依据。本研究的不足之处以及有待于深入研究的地方：1、本研究发现血浆HO-1水平与T2DM、IGR有关,但是仍有以下几点值得探讨：其一,血浆中HO-1的组织来源不清,即是否血浆HO-1水平的变化反映的是胰岛或者肝脏、骨骼肌、脂肪组织等胰岛素靶器官的组织损伤,目前尚不清楚；其二,血浆HO-1水平改变的意义是什么,到底是病因性的,还是仅仅只是一个与T2DM病理机制有关的一个标志物,目前也不清楚；其三,在T2DM发生后的病程进展过程中,血浆HO-1水平的变化趋势如何?血浆HO-1水平的变化是否能够作为T2DM预后的标志物,以及血浆HO-1水平是否与对抗糖尿病药物治疗的反应有关,尚有待进一步研究。2、HO-1是与氧化损伤密切相关的一个应激蛋白。在T2DM发病过程中,HO-1基因多态性是否与抗氧化营养素（例如硒、锌、类胡萝卜素等）存在着交互作用,值得进一步研究阐明。3、本研究表明,T2DM患者的血浆hsa-miR-122水平比非糖尿病对照人群显著升高。然而,由于目前所纳入的样本量太少,该结论尚需进一步研究证实。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 全文缩写词
• 前言
• 第一部分 血浆HO-1水平与2型糖尿病及糖尿病前期的分子流行病学研究
• 第一节 血浆HO-1水平与2型糖尿病的关联研究
• 1、研究对象与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 第二节 血浆HO-1水平与糖尿病前期的关联研究
• 1. 研究对象与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 第二部分 HO-1基因多态性、血浆铁蛋白水平与2型糖尿病的关系
• 第一节 HO-1基因多态性与2型糖尿病发病风险的Meta分析
• 1、研究对象与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 第二节 HO-1基因多态性对血浆HO-1和血浆铁蛋白水平的影响
• 1、研究对象与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 第三部分 血浆中HO-1相关microRNA水平与2型糖尿病的关系
• 1. 研究对象与方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 遗传风险模型在2型糖尿病发病预测中的应用
• 参考文献
• 附录 博士期间研究工作小结
• 致谢