论文摘要
目前对结核分支杆菌（Bacillus Tuberculosis,TB）的检测,主要靠痰涂片、培养及PCR检测等技术,存在耗时长,敏感度低和特异性差等缺点,常常导致误诊和漏诊,从而给病人带来巨大的经济负担。因此建立快速、敏感、简便的结核分支杆菌鉴定检测系统是目前国内外实验诊断学急需解决的问题,也是有效治疗和控制该类致病菌的有效手段之一。本研究通过自行设计结核分支杆菌高特异性的分子信标,并以其为探针固定在芯片表面,从而将分子信标探针的高灵敏性、高特异性优势运用于生物芯片领域,建立了一种快速鉴定结核分支杆菌的分子信标探针荧光芯片技术,为结核分支杆菌流行病学调查提供了新的技术手段。目的:设计结核分支杆菌高特异性的分子信标并构建分子信标探针型荧光芯片,建立快速鉴定结核分支杆菌的检测技术。方法:1.根据GenBank找到结核分支杆菌基因序列,选择序列号为IS986的基因序列,在Primer Premier V5.0软件上设计结核分支杆菌特异性引物。并对反应体系中MgCl2、引物、dNTP浓度以及引物退火温度优化后建立结核分支杆菌PCR反应扩增体系。通过对TB标准株、TB临床分离株和临床阳性标本扩增产物的直接测序、灵敏性试验以及特异性试验对PCR反应体系进行综合评估。2.从TB PCR反应体系的扩增片段内部取一段序列设计,经用beacon designer 2.1软件分析设计分子信标。对反应体系中的分子信标探针、MgCl2、引物以及dNTP的浓度进行优化后建立TB分子信标直接加入PCR扩增体系的杂交试验。3.通过对杂交温度、杂交时间以及杂交方式的优化,建立PCR反应后再加入TB分子信标杂交试验。4.运用荧光分光光度计和荧光显微镜对MB PCR杂交产物荧光信号的观测条件进行摸索。并进行不同荧光-淬灭分子对标记分子信标的观测试验。5.通过对传统生物素（biotin）-亲和素（avidin）连接方式和自行设计的单侧延长臂的分子信标连接方式的对比研究,对TB分子信标与芯片固定方式进行探索。6.提高单侧延长臂的分子信标芯片杂交效率部分优化包括:5/寡核苷酸探针浓度;分子信标探针浓度及纯度;杂交温度、杂交时间、杂交液配方;点样大小与点样浓度对荧光信号检测的影响;阴-阳性区分的临界值。7.TB-MB芯片的临床应用和方法学比较。主要结果:1.TB PCR反应体系阳性扩增结果为在琼脂糖凝胶电泳上出现245bp的条带。MgCl2、引物以及dNTP在TB PCR体系中优化后最佳终浓度分别为:4mmol/L、0.04μmol/L以及0.3 mmol/L。TB PCR体系的退火温度优化后为55℃。TB标准株及TB临床分离株和临床阳性标本扩增产物的直接测序结果与GenBank中公布的序列完全一致。TB PCR反应体系对其它细菌无交叉反应。检测限度为10拷贝/μl的DNA。2.TB分子信标直接加入PCR扩增体系的TB分子信标、MgCl2、引物以及dNTP最佳终浓度分别为:0.04μmol/L、5.0mmol/L、0.04μmol/L、0.3mmol/L。3.PCR反应后再加入TB分子信标杂交试验中水浴、PCR仪、恒温摇床的最适杂交温度和适杂时间分别为:55℃,6h;55℃,4h;50℃,7h。阴-阳性效果区分:水浴﹥恒温摇床﹥PCR仪。4.荧光分光光度仪检测MB PCR杂交阳性产物、MB PCR杂交阴性产物（茎环结构未打开）、无游离分子信标探针PCR产物（空白对照）三者的荧光光亮度比值为:6.102/0.136/0.003。荧光显微镜观测MB PCR杂交阳性产物、MB PCR杂交阴性产物（茎环结构未打开）荧光强度明显区别。本试验Cy3-BDH组成分子信标荧光-淬灭效率较Cy3-DABCLYE高,FAM- DABCLYE组成分子信标荧光-淬灭效率较FAM–BDH高。5.生物素-亲和素（biotin-avidin）能很好的结合在芯片上但这种修饰有相当技术难度;且生物素-亲和素连接无特异性。本设计单侧延长臂分子信标采用淬灭分子中间标记,茎结构单侧（淬灭分子一侧）延长臂,能很好的结合在芯片上,且修饰技术难度低、特异性高。6.单侧延长臂分子信标芯片杂交效率的优化结果:5/寡核苷酸探针最适浓度为40μmol/L。对较理想区分阴阳性的信号强度:Cy3-BDH荧光-淬灭分子对标记分子信标探针浓度约10μmol/L,而FAM-DABCLYE分子对标记分子信标探针浓度约15μmol/L,经65℃杂交17h有较好的杂交效果。Cy3-BDH分子信标探针浓度约15μmol/L、FAM-DABCLYE探针浓度约9μmol/L时杂交反应达到7h可检测到较强信号。杂交液的杂交结果比较:0.15 %SDS效果好于0.2 %SDS , 10×SSC效果好于5×SSC。样本随着点样直径的缩小,荧光强度不变;样本随着点样浓度的倍比减小,荧光强度也减小。7.TB-MB芯片提痰标本总检出率为57.5%（ 23/40） ,高于痰涂片27.5%（11/40）和培养35%（14/40）,经统计学处理TB-MB芯片与痰涂片、培养相比差异有显著性（分别为χ2=7.366,P=0.006<0.01;χ2=32.281 , P=0.000<0.01）。对照组20例, 1例非结核分支杆菌病痰涂片、培养均阳性, TB-MB芯片阴性;其余19例均为阴性。结论:1.TB-MB PCR反应体系能够快速对TB标准株、TB临床分离株及临床标本进行结核分支杆菌的鉴别;相对普通PCR检测具有更高的特异性和灵敏性,为结核分支杆菌高特异性分子信标荧光芯片的检测方法的建立奠定了基础。2.单侧延长臂分子信标探针设计的发明及运用,初步解决了分子信标技术在芯片技术领域运用的固定难题。巧妙地把分子信标高特异性、高灵敏性等优势自然运用到芯片技术上。3.建立起结核分支杆菌分子信标荧光芯片的检测技术,包括样本制备、芯片制备、杂交反应以及扫描和图像分析等方法。并兼顾到各种因素对单侧延长臂分子信标芯片的影响,对反应体系中各条件进行了合理的优化,使所建立的检测体系稳定可靠。4.通过与涂片、培养法共同对40例临床痰标本进行结核分支杆菌检测,证实了分子信标荧光芯片具有较高的阳性检出率和高度的灵敏性、特异性。单侧延长臂分子信标芯片能更好的运用到临床检测中。
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标签：结核分支杆菌论文; 分子信标论文; 单侧延长臂分子信标论文; 荧光芯片论文;