肝癌细胞RIG-I信号通路在肝癌免疫治疗中的意义与相关机制研究

论文摘要

肝细胞癌（Hepatocellular caicinoma,HCC）位居世界癌症死亡率的第三位,也是我国最常见的肿瘤之一,占我国肿瘤死因的第2位。研究表明HBV、HCV引起的慢性感染与肝癌的发生发展密切相关。目前对于肝癌发生发展分子机制的研究仍然不甚了解,特别是对于肝癌如何逃逸免疫监视而发生以及如何诱导免疫功能失能并导致机体免疫功能抑制,使得肝癌得以生长与转移的细胞与分子机制有待于进一步深入研究。机体通过模式识别受体（Pattern-recognition receptors,PRRs）识别病毒核酸,产生抗病毒天然免疫应答。维甲酸诱导基因I（Retinoic-acid-inducible gene I,RIG-I）作为机体识别病毒的主要免疫识别受体属于维甲酸诱导基因I样受体家族（Retinoic-acid-inducible gene I（RIG-I）-like receptors,RLRs）的主要成员,在机体的抗病毒免疫应答特别是I型干扰素的诱导产生中发挥着重要作用,此外,与细胞的生长调控也有一定的关系,是近年来免疫学基础研究的前沿热点之一。然而,RIG-I与肿瘤的发生发展之间有无联系?RIG-I的表达与肿瘤之间的相互关系如何?目前仍不是十分清楚。本研究探讨了RIG-I与肝癌之间的相互关系及其对肝癌免疫治疗的影响。一、肝癌组织中RIG-I表达降低的研究为了探讨RIG-I与肝癌之间的相互关系,我们首先利用肝癌标本组织芯片,通过免疫组化的方法检测了肝癌组织及对应的癌旁组织中RIG-I蛋白的表达情况。结果发现,在30例原发性肝癌患者中,27例患者的癌旁组织中RIG-I蛋白表达为阳性,阳性率为90%。然而,在30例肝癌患者的肝癌组织中,只有5例患者的癌组织中RIG-I蛋白表达为阳性,1例患者的癌组织中RIG-I蛋白表达为弱阳性,阳性率为20%。该结果提示RIG-I蛋白在肝癌组织中的表达显著降低。之后,我们又对肝癌患者癌组织与癌旁组织中RIG-I表达的改变进行了分析。结果表明,癌组织比癌旁组织RIG-I蛋白表达明显降低的病例占73%,无明显变化的病例占27%。我们随机挑选了其中3例病例,免疫组化结果显示癌旁组织中可见清晰的肝索组织,细胞核清晰、较均一,呈苏木素深染,胞核周围的胞浆中可见RIG-I蛋白DAB染色呈阳性。然而,肝癌组织结构杂乱,细胞呈巢团状、腺样及弥散状排列,细胞立方形或胞界不清,核大异型明显,呈苏木素深染,胞核周围RIG-I蛋白DAB染色呈弱阳性或阴性改变。上述肝癌组织芯片免疫组化检测结果提示,在肝癌患者的癌旁组织中RIG-I蛋白广泛表达,且主要在核周胞质中分布,然而,在肝癌组织中RIG-I蛋白表达明显下调。那么,除了肝癌组织,在其他肿瘤中RIG-I蛋白表达的情况如何呢?我们利用人类多器官肿瘤组织芯片和人类生殖系统肿瘤组织芯片通过免疫组化检测RIG-I蛋白的表达情况,发现在前列腺腺癌、肾透明细胞癌、子宫内膜癌和食道癌组织中,同样也存在RIG-I蛋白表达下调的现象。为了进一步确证上述结果,我们利用肝癌新鲜临床组织标本,通过提取组织总RNA和总蛋白,利用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测了RIG-I的基因和蛋白水平表达。结果发现,与正常肝组织和癌旁组织相比,肝癌组织中的RIG-I表达显著降低。可见,肝癌以及多种肿瘤组织中RIG-I表达显著降低。二、碱性FGF抑制肝癌细胞RIG-I表达及其相关机制的研究是什么原因导致了肝癌组织中RIG-I的表达显著下调呢?以往研究表明维甲酸（Acyclic retinoid,ACR）能够通过抑制碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）信号通路抑制肝癌细胞生长。而RIG-I又是维甲酸诱导表达的基因,同时,又有报道肝癌组织高表达bFGF。因此,我们推测是否是肿瘤组织内高表达的bFGF导致了RIG-I的表达下调。首先,我们用不同浓度的人重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）刺激人肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2、Hep3B和人张氏肝细胞Changliver,24小时后实时荧光定量PCR检测RIG-I基因的表达。结果发现,SMMC-7721细胞对于bFGF的刺激较为敏感,并且bFGF对RIG-I基因的表达调控较为一致,能显著降低RIG-I基因的表达,其中100ng/ml bFGF对RIG-I基因表达的抑制作用最为显著。由于FGF的信号传导主要通过其细胞表面受体所介导。因此,我们接下来通过实时荧光定量PCR检测了上述人肝癌细胞株和人张氏肝细胞中FGF不同受体（FGF receptor, FGFR）的表达情况。结果发现SMMC-7721细胞高表达FGFR1和FGFR3。那么,在临床肝癌组织标本中bFGF及其相关受体的表达又如何呢?我们通过提取肝癌新鲜临床组织标本总RNA,实时荧光定量PCR检测,发现癌组织中的RIG-I表达显著降低,而bFGF和FGFR1、FGFR3表达显著升高。为了进一步探讨bFGF对于RIG-I表达的抑制作用,我们选择了对bFGF较敏感的SMMC-7721细胞作为细胞模型,用100ng/ml的bFGF刺激SSMC-7721细胞,实时荧光定量PCR在不同时间点8小时、12小时、16小时和24小时分别检测RIG-I基因的表达。结果发现bFGF对RIG-I基因表达的抑制具有时间依赖性,24小时的抑制作用最为显著。PI3K（Phosphoinositide 3-kinase/protein kinaseB,P13K/Akt）和ERK（Extracellular signal-regulated protein kinase）通路是bFGF下游两条重要的信号通路。我们将这两条信号通路特异性的抑制剂LY294002、U0126以及FGF受体特异性的抑制剂PD173034预处理SMMC-7721细胞1小时,实时荧光定量PCR和Western blot检测结果发现其均能够有效地阻断bFGF刺激对RIG-I基因和蛋白表达的抑制作用,表明FGF通过激活PI3K和ERK信号通路抑制了肝癌细胞RIG-I的表达。三、RIG-I增强肝癌细胞对干扰素免疫治疗敏感性的研究干扰素（Interferon, IFN）作为一种病毒抑制因子,不仅具有抗病毒作用,而且还具有免疫调节、抑制细胞增殖以及诱导细胞分化等作用。目前,人重组的干扰素α（Recombinant human IFN-α, rhIFN-α）已广泛应用于临床抗病毒和抗肿瘤治疗,包括应用于肝癌的临床治疗。RIG-I信号通路的活化能够促进干扰素的产生,而干扰素又能够进一步的促进RIG-I的表达,从而形成一个正反馈过程。那么,RIG-I过表达对肝癌细胞干扰素α的免疫治疗有何影响呢?首先,我们选择500IU/ml、1000IU/m和2000IU/ml的人重组干扰素α（rhIFN-α）刺激SMMC-7721细胞,通过MTT检测SMMC-7721细胞增殖情况。结果发现不同剂量的rhIFN-α对细胞生长的体外抑制作用无显著差异,提示SMMC-7721细胞对rhIFN-α的刺激不敏感。接着,我们将人全长RIG-I真核表达质粒转染SMMC-7721细胞,转染后24小时加入2000IU/ml rhIFN-α刺激,MTT检测细胞的增殖情况。结果发现RIG-I过表达能够明显增强rhIFN-α抑制肝癌细胞的增殖。那么,这种抑制增殖的作用是如何产生的呢?我们将人全长RIG-I真核表达质粒转染SMMC-7721细胞,转染后24小时加入2000IU/ml rhIFN-α刺激,24小时后流式细胞仪检测结果发现RIG-I过表达后rhIFN-α刺激能够使肝癌细胞G2/M期的细胞数明显增加,提示促进了细胞周期G2/M期的阻滞。同时应用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况,发现RIG-I过表达后rhIFN-α刺激能够促进肝癌细胞的凋亡。综上所述,我们的结果提示在肝癌细胞中bFGF通过FGFR1和FGFR3活化PI3K和ERK信号通路,抑制RIG-I的表达。人肝癌细胞株SMMC-7721过表达RIG-I后,能够显著增强rhIFN-α对细胞增殖的抑制作用,分析表明其增强了rhIFN-α诱导的肝癌细胞G2/M期的周期阻滞和促进肝癌细胞的凋亡,从而增强肝癌细胞对rhIFN-α的敏感性。该结果为肝癌免疫逃逸机制研究以及未来肝癌的免疫治疗提出了新的方向。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 肝癌组织中 RIG-I 表达降低的研究
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 第二部分 碱性FGF 抑制肝癌细胞RIG-I 表达及其相关机制的研究
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 第三部分 RIG-I 增强肝癌细胞对干扰素免疫治疗敏感性的研究
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述 RIG-I 结构与功能研究进展
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况
• 致谢