虫害诱导的水稻胰蛋白酶抑制剂合成的相关机理研究

论文摘要

植物蛋白酶抑制剂是一类重要的防御化合物，能被害虫取食所诱导，并且其合成与害虫所激活的信号分子有关。在水稻上，已有研究表明，稻纵卷叶螟取食能诱导水稻胰蛋白酶抑制剂的合成，并且不同取食习性的水稻害虫（二化螟、稻纵卷叶螟和褐飞虱）所激活的水稻信号分子存在明显差异。但至今尚不清楚不同取食习性水稻害虫在取食诱导水稻蛋白酶抑制剂合成中的异同，以及各类信号分子在其中的作用。为此，本文以4种取食习性不同的水稻害虫，即蛀食茎杆的二化螟、取食叶片的稻纵卷叶螟和刺吸韧皮部汁液的稻飞虱（褐飞虱和白背飞虱）为研究对象，在过去研究工作的基础上，主要对这4种害虫取食为害诱导水稻胰蛋白酶抑制剂含量的时序变化进行了比较研究，同时分析了稻纵卷叶螟取食为害后，水稻不同部位胰蛋白酶抑制剂以及与防御相关的3种重要信号分子茉莉酸、水杨酸和乙烯含量的时序变化，并通过外用信号分子处理和反向遗传学方法解析了水杨酸和乙烯信号转导途径在稻纵卷叶螟取食诱导水稻胰蛋白酶抑制剂合成中的作用。结果如下：1)健康水稻茎中的胰蛋白酶抑制剂含量高于健康叶片，并且受昼夜节律的影响较为明显；在黑暗条件下，水稻茎中胰蛋白酶抑制剂的含量明显增加。除黄熟期外，稻纵卷叶螟为害能显著增加水稻分蘖期、孕穗期和扬花期叶片中胰蛋白酶抑制剂的含量，但在茎中，这4个生育期的胰蛋白酶抑制剂含量都不增加，相反在孕穗期、扬花期和黄熟期显著低于健康水稻茎中的含量。2)比较了水稻分蘖期在受4种害虫取食为害后胰蛋白酶抑制剂含量的变化。结果表明，除了取食叶片的稻纵卷叶螟只能诱导叶中胰蛋白酶抑制剂含量显著上升外，其余3种为害叶鞘或茎秆的害虫，均能诱导水稻叶及茎内胰蛋白酶抑制剂含量的显著增加。说明害虫取食诱导的水稻胰蛋白酶抑制剂含量的上升具有一定的系统性，并且这种系统信号更易由下往上传递。此外，也发现在同为为害叶鞘或茎秆的害虫中，以咀嚼式口器的二化螟所诱导的胰蛋白酶抑制剂含量上升最为明显，而刺吸式口器的稻飞虱则诱导效果较弱。3)测定了稻纵卷叶螟取食为害后分蘖期水稻不同部位胰蛋白酶抑制剂及茉莉酸、水杨酸和乙烯这3种与防御相关的重要信号分子含量的变化。结果表明，稻纵卷叶螟取食为害除了能导致为害叶胰蛋白酶抑制剂含量的明显上升外，还能引起为害叶上位叶以及下位叶含量的上升，但下位叶含量的上升要迟于上位叶的；同时，也发现稻纵卷叶螟取食为害，不引起水稻茎秆和根中胰蛋白酶抑制剂含量的上升。进一步论证了损伤信号主要由下往上传送的可能结果。稻纵卷叶螟取食为害不能激活水稻体内的茉莉酸信号转导途径，但是可以激活水杨酸和乙烯信号转导途径。以一定浓度的水杨酸和乙烯利分别处理水稻，能诱导水稻体内胰蛋白酶抑制剂含量的增加，但是使用水杨酸和乙烯利联合处理并没有明显的协同增效作用。4)克隆了水稻ACS基因的全长序列，并利用其部分序列构建了反义表达载体，通过农杆菌介导法，获得了反义抑制ACS基因的T1水稻品系。分析表明，反义抑制ACS水稻品系在受稻纵卷叶螟取食为害时，乙烯释放量显著低于相同处理的对照品种秀水11，但胰蛋白酶抑制剂含量在反义抑制ACS品系与对照品种间没有明显差异。说明ACS在稻纵卷叶螟取食诱导的水稻乙烯释放中起着重要作用，但乙烯信号转导途径在稻纵卷叶螟取食诱导的水稻胰蛋白酶抑制剂合成中作用不明显。5)克隆了水稻COI1基因的全长序列，并利用其部分序列构建了反义表达载体，利用农杆菌介导法，最终获得了8个反义抑制COI1基因的纯合水稻品系。为阐明茉莉酸信号转导途径在虫害诱导的胰蛋白酶抑制剂合成中的作用奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述及本研究的目的和意义
• 1.植物蛋白酶抑制剂
• 1.1 植物蛋白酶抑制剂的分布和分类
• 1.2 植物蛋白酶抑制剂的生物学功能
• 1.3 植物蛋白酶抑制剂的抗虫机理
• 1.4 植物蛋白酶抑制剂可能的诱导合成机制
• 2.ACC合成酶在乙烯信号转导途径中的作用
• 2.1 乙烯信号转导途径
• 2.2 乙烯合成途径中的ACS基因
• 3.COI1基因在茉莉酸信号途径的作用
• 3.1 茉莉酸信号转导途径
• 3.2 COI1介导的茉莉酸信号转导途径
• 4.反向遗传学
• 5.本研究的目的和意义
• 第二章 基本材料和方法
• 1.供试水稻
• 2.供试昆虫
• 2.1 褐飞虱
• 2.2 白背飞虱
• 2.3 稻纵卷叶螟
• 2.4 二化螟
• 3.化学试剂与药品
• 4.水稻蛋白酶抑制剂含量的测定
• 4.1 取样
• 4.2 蛋白酶抑制剂的提取
• 4.3 水稻胰蛋白酶抑制剂含量的测定
• 5 水稻三种信号分子的含量测定
• 5.1 茉莉酸和水杨酸
• 5.2 乙烯
• 6.实验数据的统计分析
• 第三章 四种害虫取食为害对水稻胰蛋白酶抑制剂诱导作用的比较
• 1.材料和方法
• 1.1 供试水稻
• 1.2 供试昆虫
• 1.3 水稻处理
• 1.4 昼夜节律
• 1.5 水稻生育期对胰蛋白酶抑制剂可诱导性的影响
• 1.6 四种害虫取食对水稻胰蛋白酶抑制剂诱导作用的比较
• 1.7 胰蛋白酶抑制剂含量的测定
• 1.8 实验数据的统计分析
• 2.结果与分析
• 2.1 昼夜节律
• 2.2 不同生育期对胰蛋白酶抑制剂的可诱导性比较
• 2.3 不同害虫为害后水稻叶内胰蛋白酶抑制剂含量的时序变化
• 2.4 不同害虫为害后水稻茎内胰蛋白酶抑制剂含量的时序变化
• 3.讨论
• 第四章 稻纵卷叶螟取食诱导水稻胰蛋白酶抑制剂合成的机理
• 1.材料和方法
• 1.1 供试水稻
• 1.2 稻纵卷叶螟
• 1.3 水稻处理
• 1.4 胰蛋白酶抑制剂含量的测定
• 1.5 信号分子含量的测定
• 1.6 实验数据的统计分析
• 2.结果与分析
• 2.1 稻纵卷叶螟为害后水稻植株不同部位胰蛋白酶抑制剂含量的变化
• 2.2 稻纵卷叶螟为害对水稻体内信号分子含量的影响
• 2.3 不同信号分子对水稻胰蛋白酶抑制剂的诱导
• 3.讨论
• 第五章 反义抑制ACS研究乙烯信号途径在水稻TrypPI诱导合成中的作用
• 1.材料和方法
• 1.1 供试水稻
• 1.2 供试菌株
• 1.3 植物表达载体质粒
• 1.4 常用化学试剂及仪器
• 1.5 常用抗生素及培养基配方
• 1.6 水稻ACS基因的克隆
• 1.7 反义抑制ACS水稻品系的构建
• 1.8 反义抑制ACS水稻品系乙烯释放量测定
• 1.9 反义抑制ACS水稻品系胰蛋白酶抑制剂含量测定
• 2.结果与分析
• 2.1 水稻Os-ACS基因的克隆
• 2.2 ACS反义表达载体的构建
• 2.3 转基因植株的获得
• 2.4 反义抑制ACS基因对水稻乙烯释放量的影响
• 2.5 反义抑制ACS基因对水稻TrypPI含量的影响
• 3.讨论
• 第六章 反义抑制COI1基因水稻品系的建立
• 1.材料和方法
• 1.1 供试水稻
• 1.2 供试菌株
• 1.3 植物表达载体质粒
• 1.4 常用化学试剂及仪器
• 1.5 常用抗生素及培养基配方
• 1.6 水稻基因COI1的克隆
• 1.7 反义抑制COI1水稻品系的建立
• 2.结果与分析
• 2.1 水稻Os-COI1基因的克隆
• 2.2 COI1反义表达载体的构建
• 2.3 转基因植株的获得
• 3.讨论
• 第七章 总讨论
• 参考文献
• 附录A
• 附录B
• 附录C