亮氨酸缺失诱导C2C12细胞自吞噬过程中microRNAs的鉴定与功能分析

论文摘要

支链氨基酸（branched-chain amino acids, BCAAs）是一组在碳链上具有支链结构的脂肪族中性氨基酸,包括亮氨酸（Leucine）、异亮氨酸（Isoleucine）和缬氨酸（Valine）,均为动物体内不能合成的必需氨基酸,支链氨基酸尤其是亮氨酸对哺乳动物蛋白质合成和骨骼肌蛋白质周转调节等方面具有重要的生物学功能。最近研究表明亮氨酸可作为介导哺乳动物细胞生物大分子降解的细胞自吞噬的重要调节分子,主要通过mTOR-ULK1复合体的机制调节自吞噬的活性。微小RNA（microRNAs, miRNAs）是生物体内源一类长度约为20～23个核苷酸的非编码小RNA分子,通过与靶mRNA互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控,促进靶mRNA的降解或翻译抑制。越来越多的研究报告表明microRNA具有调节细胞增殖、死亡神经细胞分化、个体发育等生物学功能,microRNA的发现为人们提供了一种全新的角度来认识生物基因和基因表达调控的本质,但是microRNA在细胞自吞噬尤其是亮氨酸介导的自吞噬中的作用有待阐明。本研究通过microRNA芯片技术结合荧光定量PCR技术筛选亮氨酸缺失诱导C2C12成肌细胞自吞噬发生过程中的差异表达microRNA,利用生物信息学结合双荧光素酶报告基因试验技术、western blot技术验证候选microRNA的靶基因,并通过microRNA转染试验验证候选microRNA在亮氨酸缺失诱导的C2C12成肌细胞自吞噬发生过程中的作用,取得如下主要结果：1.如同其他细胞系一样,亮氨酸缺失可以有效诱导C2C12成肌细胞的自吞噬活性,通过共聚焦显微镜观察LC3与LAMP1共定位及western blot检测自吞噬活性标志蛋白LC3-Ⅱ与p62的表达水平,亮氨酸缺失4h到8h可以有效诱导C2C12成肌细胞的自吞噬活性（P<0.05）,随着亮氨酸缺失时间的延长,自吞噬活性降低。2.亮氨酸可以作为C2C12成肌细胞细胞周期的调节物,亮氨酸缺失将诱导C2C12成肌细胞G1期细胞所占比例显著性增加,而S期细胞所占比例显著性降低（P<0.05）,表明亮氨酸缺失诱导细胞周期停滞于G1期。3.在亮氨酸缺失培养基培养的C2C12成肌细胞中,通过microRNA表达谱芯片技术,我们筛选到86个差异表达的microRN As,进一步通过荧光定量PCR技术验证了其中一部分的表达变化。4. microRNA芯片技术发现在亮氨酸缺失培养基培养的C2C12成肌细胞中,miR-17 microRNA家族8个成员均发生表达抑制,荧光定量PCR技术发现miR-20a与miR-106b下调倍数尤为明显,且在C2C12成肌细胞中存在同样的现象。5.通过研究miR-20a/miR-106b的转录因子c-myc发现,亮氨酸缺失的C2C12成肌细胞与肌细胞中c-myc表达均受到抑制,因此推测亮氨酸缺失诱导C2C12成肌细胞与肌细胞中miR-20a/miR-106b的表达抑制是后者转录因子c-myc的表达抑制介导的。6.通过生物信息学分析结合双荧光素酶报告基因技术与western blot技术发现自吞噬发生早期重要基因ULK1是miR-20a/miR-106b的靶基因,miR-20a/miR-106b可结合于ULK1的mRNA3’-UTR的485-491bp处并以转录后基因沉默的模式抑制靶基因ULK1的蛋白质翻译。7.通过共聚焦显微镜观察LC3与LAMP1共定位及western blot检测自吞噬活性标志蛋白LC3-Ⅱ与p62的表达水平发现miR-20a或miR-106b转染的C2C12成肌细胞对亮氨酸缺失诱导的自吞噬活性不再敏感,miR-20a/miR-106b可抑制亮氨酸缺失诱导的C2C12成肌细胞的自吞噬活性。综合所有的试验结果,我们提出了以下结论：亮氨酸缺失诱导C2C12成肌细胞自吞噬活性是miR-20a/miR-106b介导的,亮氨酸缺失通过抑制转录因子c-myc的表达导致miR-20a/miR-106b的表达抑制,导致ULK1蛋白表达上调从而诱导自吞噬的发生。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 自吞噬的发生过程及自吞噬体的形态特征
• 1.1.1 自吞噬的发生过程
• 1.1.2 自吞噬体的形态特征
• 1.2. 细胞自吞噬的分类及其作用机理
• 1.2.1 细胞自吞噬的分类
• 1.2.2 细胞自吞噬的作用机理
• 1.2.2.1 大自吞噬的作用机制
• 1.2.2.2 小自吞噬的作用机制
• 1.2.2.3 分子伴侣介导的自吞噬的作用机制
• 1.3. 细胞自吞噬的信号调控
• 1.3.1 雷帕霉素靶蛋白（target of rapamycin,TOR）信号对自吞噬的调控
• 1.3.2 磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinases,PI3Ks）信号对自吞噬的调控
• 1.3.3 死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase,DAPK）信号对自吞噬的调控
• 1.3.4 AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）信号对自吞噬的调控
• 1.4. 细胞自吞噬在生命活动中的作用
• 1.4.1 细胞自吞噬与营养稳态
• 1.4.2 细胞自吞噬与生长分化
• 1.4.3 细胞自吞噬与癌症
• 1.4.4 细胞自吞噬与病原体感染
• 1.5. 细胞自吞噬的研究方法
• 1.5.1 透射电子显微镜技术
• 1.5.2 Atg8/LC3及p62蛋白的表达检测
• 1.5.3 荧光显微镜技术
• 1.6. microRNAs
• 1.7. microRNA介导营养素敏感的信号通路调控营养代谢
• 1.7.1 microRNA与mTOR信号通路
• 1.7.2 microRNA与PI3K信号通路
• 1.7.3 microRNA与AMPK信号通路
• 1.8. 细胞自吞噬、microRNA与亮氨酸
• 1.8.1 细胞自吞噬与microRNA
• 1.8.2 亮氨酸与细胞自吞噬
• 1.9.本课题目的、意义及研究内容
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 细胞系、菌种、质粒与载体
• 2.1.2 试验药品、试剂及试剂盒
• 2.1.3 培养基及其配制
• 2.1.4 试验缓冲液及其配制
• 2.1.5 仪器设备
• 2.1.6 技术服务、生物学软件及数据库
• 2.1.6.1 技术服务
• 2.1.6.2 生物学软件
• 2.1.6.3 主要数据库
• 2.2. 试验方法
• 2.2.1 C2C12成肌细胞中亮氨酸缺失诱导细胞自吞噬的检测
• 2.2.1.1 LAMP1-RFP融合表达质粒的构建
• 2.2.1.2 细胞培养主要方法
• 2.2.1.3 共聚焦显微镜观察LC3-GFP及LAMP1-RFP共定位
• 2.2.1.4 SDS-PAGE/蛋白质印迹检测自吞噬活性
• 2.2.1.5 流式细胞术检测亮氨酸缺失对C2C12成肌细胞周期的影响
• 2.2.2 C2C12成肌细胞亮氨酸缺失的microRNA表达变化检测
• 2.2.2.1 C2C12成肌细胞亮氨酸缺失的microRNA表达谱芯片分析
• 2.2.2.2 microRNA芯片结果的荧光定量PCR确认
• 2.2.2.3 C2C12肌细胞亮氨酸缺失诱导的microRNA表达谱变化
• 2.2.2.4 miR-20a及miR-106b转录因子的验证
• 2.2.2.5 miR-20a及miR-106b转录因子c-myc转录活性的验证
• 2.2.2.6 亮氨酸缺失处理的C2C12成肌细胞与肌细胞中c-myc的表达变化
• 2.2.3 miR-20a及miR-106b靶基因分析
• 2.2.3.1 miR-20a及miR-106b靶基因预测
• 2.2.3.2 miR-20a及miR-106b靶基因的验证
• 2.2.4 C2C12成肌细胞中miR-20a及miR-106b在亮氨酸缺失诱导自吞噬发生过程中的作用检测
• 2.2.4.1 亮氨酸缺失的C2C12成肌细胞中靶基因ULK1表达变化检测
• 2.2.4.2 C2C12成肌细胞中miR-20a及miR-106b在亮氨酸缺失诱导自吞噬发生过程中的作用检测
• 3 试验结果
• 3.1 C2C12成肌细胞中亮氨酸缺失诱导细胞自吞噬的活性
• 3.1.1 GFP-LC3及RFP-LAMP1融合蛋白表达质粒构建结果
• 3.1.2 C2C12成肌细胞中亮氨酸缺失诱导细胞自吞噬的活性的结果
• 3.1.3 SDS-PAGE/western blot检测亮氨酸缺失诱导C2C12细胞自吞噬的结果
• 3.1.4 亮氨酸缺失对C2C12成肌细胞周期影响的结果
• 3.2 C2C12成肌细胞与肌细胞亮氨酸缺失诱导的microRNA表达变化
• 3.2.1 C2C12细成肌胞亮氨酸缺失的microRNA表达谱芯片结果
• 3.2.2 亮氨酸缺失处理诱导C2C1成肌细胞与肌细胞中miR-20a及miR-106b的表达结果
• 3.2.3 miR-20a/miR-106b转录因子验证的结果
• 3.2.4 c-myc转录活性验证的结果
• 3.2.5 亮氨酸缺失处理的C2C12成肌细胞与肌细胞c-myc的表达变化
• 3.3 miR-20a/miR-106b靶基因分析结果
• 3.3.1 ULK1-psiCHECK2质粒构建结果
• 3.3.2 双荧光素酶报告基因试验验证miR-20a/miR-106b靶向ULK1的结果
• 3.3.3 miR-20a/miR-106b超表达对ULK1表达影响的结果
• 3.4 miR-20a/miR-106b在亮氨酸缺失诱导C2C12成肌细胞自吞噬发生过程中的作用
• 4 讨论
• 4.1 microRNA在细胞自吞噬调控中的作用
• 4.2 miR-20a/miR-106b的生物学功能
• 4.3 受亮氨酸调节的microRNA
• 4.4 亮氨酸在细胞自吞噬与细胞周期调节中的作用
• 4.5 ULK1在细胞自吞噬调节中的作用
• 4.6 c-myc调节microRNA与细胞自吞噬
• 5 小结
• 5.1 本研究主要结论
• 5.2 本研究的特色与创新点
• 5.3 值得进一步研究的问题
• 在读期间发表论文
• 参考文献
• 致谢