超嗜热古菌Aeropyrum pernix K1酰基肽水解酶/酯酶N-末端区域稳定化机制研究

论文摘要

研究N-末端区域对酶稳定性的影响,不但能够加深了解酶的稳定化机制,而且对促进蛋白质分子设计和工程酶的应用具有重要意义。来源于超嗜热古菌Aeropyrum pernix K1基因APE1547的重组蛋白表现酰基肽水解酶和酯酶的催化活性,其生物学稳定性极好。晶体结构分析表明,该酶由两个结构域组成。通过同源结构比较,发现N-末端区域具有连接两个结构域的作用,为揭示N-末端结构对酶活性及稳定性的影响,本论文构建了N-末端氨基酸缺失和两对盐桥消除的系列突变体。动力学、热力学及结构信息学分析揭示出,N-末端增加了局部稳定域的数量并增强了稳定域的刚性,阐明了其可能的区域稳定化机制。本研究为酶的稳定化设计提供了理论依据。

论文目录

• 第一章 前言
• 1. 极端微生物简介
• 2. 嗜热微生物和超嗜热微生物
• 3. 嗜热酶简介
• 3.1 酯酶与脂肪酶
• 3.2 蛋白酶和肽酶
• 4. 嗜热酶的稳定性
• 4.1 热力学稳定性
• 4.2 酶的动力学稳定性
• 4.3 嗜热酶热稳定性的结构基础
• 5. 酶的稳定化研究
• 5.1 定点突变
• 5.2 分子动力学模拟与稳定化理性设计
• 5.3 酶稳定性的体外定向进化
• 6. 本论文的研究背景及立论依据
• 7. 参考文献
• 第二章 同源比较与突变体构建及酶学性质分析
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 三级结构同源分析
• 2.2 溶液配制
• 2.3 突变体的构建
• 2.4 蛋白表达与分离纯化
• 2.5 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.6 考马斯亮兰法测定蛋白质浓度
• 2.7 酶学性质分析
• 3. 结果
• 3.1 APE1547 的同源结构比较分析
• 3.2 突变体的构建与鉴定
• 3.3 蛋白浓度测定的标准曲线
• 3.4 野生型和突变体的分离纯化
• 3.5 野生型和突变体的酶学性质
• 3.6 pH 对野生型及突变体催化活性的影响
• 3.7 野生型和突变体的底物特异性比较
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 6. 参考文献
• 第三章 热稳定性机制研究
• 1. 引言
• 2. 实验方法
• 2.1 热失活动力学研究
• 2.2 圆二色谱测定
• 2.3 荧光光谱测定
• 2.4 差式扫描量热测定酶热力学常数
• 3. 结果
• 3.1 野生型和突变体酶的热失活动力学
• 3.2 野生型和突变体热变性的二级结构变化
• 3.3 野生型和突变体酶热变性的三级结构变化
• 3.4 野生型和突变体酶热变性过程的热力学研究
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 6. 参考文献
• 第四章 化学变性剂对稳定性的影响
• 1. 引言
• 2. 实验方法
• 2.1 荧光光谱测定
• 2.2 平衡解折叠模型的构建与数据处理
• 2.3 酶在盐酸胍中的残余活性测定
• 2.4 盐酸胍变性后复性过程测定
• 3. 结果
• 3.1 野生型和突变体在不同浓度盐酸胍中的解折叠研究
• 3.2 野生型和突变体在盐酸胍溶液中的残余活性与构象变化分析
• 3.3 野生型和突变体解折叠模型拟合与热力学参数
• 3.4 盐酸胍浓度对复性的影响
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 6. 参考文献
• 结论与展望
• 一、 结论
• 二、 展望
• 创新点
• 攻读博士期间研究成果
• 摘要
• ABSTRACT
• 致谢
• 作者简历