兔隐孢子虫生物学特性和分子遗传学特征研究

论文摘要

隐孢子虫（Cryptosporidium）是重要的人兽共患原虫之一,可引起以胃肠炎和腹泻为特征的隐孢子虫病,目前广泛流行于世界各地。兔隐孢子虫是新近发现的人兽共患隐孢子虫种,已引起全球关注。2008年7月,英国北安普敦州暴发一起由C. cuniculus引起的人隐孢子虫病,与饮用污染的自来水有关;尼日利亚也报道儿童感染C. cuniculus。鉴于C. cuniculus是新近发现的人兽共患隐孢子虫种类之一,且该种在我国广泛存在,急需了解其宿主范围和生物学特性,及其在隐孢子虫病传播中存在的潜在威胁。本研究对河南省部分地区兔隐孢子虫进行了分子流行病学调查,从形态学、动物感染试验、宿主范围、致病性及分子遗传特性等方面研究了兔隐孢子虫的生物学特性。河南是家兔养殖大省,为获得近期河南部分地区家兔隐孢子虫病流行数据,获得兔隐孢子虫分离株,本试验进行了河南省部分地区家兔隐孢子虫分子流行病学调查。在河南省不同地区的11个家兔养殖场,采集家兔粪便样品共计1144份,应用改良抗酸染色法和饱和蔗糖溶液漂浮法进行检测。调查结果显示兔隐孢子虫感染阳性率为3.85%（44/1144）。从年龄上看,以1到6月龄的兔感染率偏高,7月龄以上的兔感染率偏低,其中1到3月龄的感染率为7.62%,4到6月龄的感染率为4.43%,7至12月龄感染率为0.56%,兔日龄一年以上感染率为1.43%。从44份隐孢子虫阳性样品中分离的卵囊大小和形态结构基本一致,对50个卵囊进行形态测量,大小为4.9μm～5.4μm×4.5μm～5.1μm,平均大小为5.14μm×4.8μm,长宽比为1.07。为了解兔隐孢子虫的宿主范围及致病性等生物学特性,本试验分别用兔隐孢子虫卵囊感染了不同免疫状态的蒙古沙鼠、不同日龄的日本大耳白家兔、30日龄BABL/c小鼠、3日龄罗曼公雏。结果显示:兔隐孢子虫能感染免疫正常的30日龄日本大耳白家兔,不同剂量对仔兔的感染力有差异,10个卵囊即可感染成功。引起的组织损伤及临床症状也存在差异。兔隐孢子虫能感染免疫正常的90日龄日本大耳白家兔和免疫抑制幼龄蒙古沙鼠。在免疫抑制程度不同的情况下,对沙鼠的感染力有差异,引起的组织损伤及临床症状也存在差异。兔隐孢子虫不感染免疫抑制BABL/c小鼠、罗曼蛋鸡公雏。通过比较动物感染后的临床症状、虫体寄生量、寄生部位和病理变化,同时测定感染动物的排卵囊规律、体重变化等一系列指标来初步确证不同动物感染兔隐孢子虫或同种动物感染不同剂量的致病性差异。研究结果显示,在不同动物体内的潜隐期、显露期及排卵囊量均不同;同时感染剂量不同时,潜隐期、显露期及排卵囊量也存在差异。组织形态学观察发现虫体主要寄生于小肠绒毛刷状缘,寄生部位肠黏膜表面出现凹陷,肠绒毛脱落或变短。上述结果为进一步研究隐孢子虫的传播机制及防治方法奠定了基础。为进一步分析获得的隐孢子虫阳性样品的分子特性及遗传稳定性,本研究采用巢式PCR-RFLP方法,基于18S rRNA基因位点进行样品扩增,分别用限制性内切酶SspⅠ和VspⅠ对该目的片段酶切,并进行RFLP分析。对基于GP60基因PCR产物测序,然后用分子生物学分析软件对获得的序列进行种系发育分析及同源性比较,在基因亚型水平上鉴定获得的分离株。结果显示,来自于自然感染家兔的隐孢子虫卵囊及动物感染后获得的隐孢子虫卵囊都为兔隐孢子虫（C. cuniculus）,均属于Vb亚型家族,进化树分析显示,与英国报道的一个人隐孢子虫病散发病例分离株（GenBank登录号为GU971648.1）基因序列在同一进化枝上。其中传代用的分离株为VbA36,与GU971648.1同源性为100%。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 文献综述
• 引言
• 1.人兽共患的隐孢子虫种简介
• 2.兔隐孢子虫研究进展
• 第一部分 河南省兔隐孢子虫分子流行病学调查及虫株分离鉴定
• 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 结论与讨论
• 第二部分 兔隐孢子虫的生物学特性研究
• 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 结论与讨论
• 第三部分 兔隐孢子虫分子遗传特性研究
• 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 结论与讨论
• 第四部分 结论与创新点
• 1 结论
• 2 创新点
• 参考文献
• 英文摘要