溶酶体半胱氨酸蛋白酶生理功能的研究

论文摘要

第一部分 在半胱氨酸蛋白酶中，组织蛋白酶(Cat)L是最有效的哺乳动物弹性蛋白酶和胶原蛋白酶，在多数检验的组织和细胞型中以基础水平广泛表达，并受促炎性刺激的调控。炎性动脉疾病腹主动脉瘤(AAA)和粥样动脉硬化包含了广泛的组织重建，而这种重建要求弹性蛋白和胶原蛋白的水解。组织蛋白酶L可能在人AAA和粥样动脉硬化损伤(粉瘤)中过表达，且在损伤的血管细胞型中的表达可能被促炎型因子所调控，本研究检验了这一假说。免疫组化和免疫印迹分析证明了，在人AAA和粉瘤中Cat L表达的升高，且表达定位于损伤部位的平滑肌细胞(SMC)、内皮细胞(EC)和巨噬细胞中。在原代培养的人SMC、EC和单核细胞来源的巨噬细胞中，促炎性细胞因子或生长因子诱导了Cat L的表达及其对胞外胶原蛋白和弹性蛋白的活性。用定量冠脉造影区分了冠脉狭窄(n=65)病人和无可检测损伤的病人(n=30)，前者的血清组织蛋白酶L水平更高(1.47±0.33ng／ml vs．0.60±0.06 ng／ml，p＜0.02)。冠脉狭窄病人中，左前降支的狭窄百分率和血清组织蛋白酶水平间存在极显著的相关性(R=0.542，p＜0.0001)，这也提示了Cat L在这些血管疾病中的重要作用。 粥样动脉硬化和糖尿病是紧密相关的，二者都包含了大量的主动脉弹性蛋白的降解，并且糖尿病动物主动脉的弹性蛋白活性升高。实验证明了，在人粥样动脉硬化损伤中，具有弹性蛋白水解活性的Cat S量的升高，但其内源抑制剂cystatin C的量是降低的，这提示了在粥样动脉硬化或糖尿病人中Cat S和／或cystatin C的血清水平可能被改变。本研究用ELISA测定了240名病人的Cat S和cystatin C的血清水平。在这些病人中，107名是粥样动脉硬化病人(具有冠状动脉的狭窄)，103名有糖尿病，30人(正常人)无这两种疾病。多线性回归分析证明了粥样动脉硬化病人(p＜0.04)与糖尿病人(p=0.0005)血清Cat S水平升高，在对cystatin C水平、肾功能、吸烟和血糖水平调整后，显著性依旧(p=0.008，p=0.0005)。此外，在对急性心肌梗塞(p=0.009)或陈旧性心肌梗塞(p＜0.02)或不稳定心绞痛(p＜0.05)病人的吸烟、肌酐、cystatin C和血糖水平调整后，其Cat S水平也较正常人更高。相反，在对年龄、吸烟和肾功能调整后，糖尿病患者比正常人有更高的血清cystatin C水平(p=0.00001)，而正常人与粥样动脉硬化病人则是无显著性差异(p=0.14)。虽然Cat S或cystatin C在粥样动脉硬化和糖尿病中的病理生理学作用还需要进一步的研究，但是血清Cat S水平的升高提示该指标可能成为这两种疾病的生物标记，而应用于临床监测。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 第一部分 哺乳动物溶酶体半胱氨酸蛋白酶与粥样动脉硬化等疾病的关系
• 1 综述
• 1.1 半胱氨酸蛋白酶
• 1.1.1 蛋白酶
• 1.1.2 半胱氨酸蛋白酶的分类
• 1.2 溶酶体半胱氨酸蛋白酶
• 1.2.1 概论
• 1.2.2 溶酶体半胱氨酸蛋白酶作用的结构与机制
• 1.2.3 溶酶体半胱氨酸蛋白酶原的活化
• 1.2.4 溶酶体半胱氨酸蛋白酶活性调控
• 1.2.5 溶酶体半胱氨酸蛋白酶生理功能
• 1.2.5.1 溶酶体半胱氨酸蛋白酶和MHC Ⅱ类抗原递呈
• 1.2.5.2 骨重建和Cat K的特异作用
• 1.2.5.3 半胱氨酸蛋白酶在肿瘤中
• 1.2.5.4 凋亡和溶酶体半胱氨酸蛋白酶
• 1.3 溶酶体半胱氨酸蛋白酶与粥样动脉硬化
• 1.3.1 粥样动脉硬化与蛋白酶
• 1.3.2 半胱氨酸蛋白酶及其抑制剂Cystatin C的表达调控
• 1.3.2.1 粥样动脉硬化中溶酶体半胱氨酸蛋白酶的过量表达和Cystatin C的缺乏
• 1.3.2.2 溶酶体半胱氨酸蛋白酶与CystatinC在体外的表达与分泌
• 1.3.2.3 溶酶体半胱氨酸蛋白酶在胞外的水解活性
• 1.3.3 溶酶体半胱氨酸蛋白酶与粥样动脉硬化
• 1.3.3.1 起始期
• 1.3.3.2 发展期
• 1.3.3.3 并发期
• 1.3.4 结论
• 2 实验内容与研究意义
• 2.1 研究背景与意义
• 2.1.1 Cat L在人粥样动脉硬化、腹主动脉瘤和血管细胞中的功能研究
• 2.1.2 Cat S在粥样动脉硬化和糖尿病病人中血清水平的研究
• 2.1.3 小鼠Cat R基因结构、特性与启动子功能的初步研究
• 2.2 实验流程
• 3 材料与方法
• 3.1 病人的选择
• 3.1.1 心血管病人与正常人的选择
• 3.1.2 糖尿病病人的选择
• 3.2 样品的收集和病人信息记录
• 3.3 人Cat S的ELISA分析
• 3.4 人Cat L的ELISA分析
• 3.5 人Cystatin C的ELISA分析
• 3.6 组织切片免疫组化基本方法
• 3.7 SDS-PAGE电泳
• 3.8 Western blot
• 3.9 细胞培养
• 3.10 总RNA的抽提和mRNA纯化
• 3.10.1 总RNA抽提
• 3.10.2 mRNA纯化
• 3.11 反转录及Real-time PCR
• 3.12 PCR及引物设计
• 3.13 DNA电泳
• 3.14 半胱氨酸蛋白酶活性位标记分析
• 3.15 弹性蛋白和胶原蛋白水解活性分析
• 3.16 统计分析
• 3.17 随机引物法标记杂交探针
• 3.18 Northern杂交
• 3.19 链末端终止法测序
• 3.20 引物延伸分析
• 4.结果与讨论
• 4.1 Cat L在人粥样动脉硬化、腹主动脉瘤和血管细胞中的表达与调控
• 4.1.1 结果
• 4.1.1.1 在AAAs和粉瘤中升高的Cat L表达
• 4.1.1.2 Cat L与SMC、EC和MΦ共定位
• 4.1.1.3 促炎性细胞因子和生长因子调控了体外Cat L的表达或活性
• 4.1.1.4 粥样动脉硬化病人中升高的血清Cat L水平
• 4.1.2 讨论
• 4.2 在粥样动脉硬化和糖尿病病人中升高的血清Cat S水平
• 4.2.1 结果
• 4.2.1.1 粥样动脉硬化狭窄病人的Cat S和Cystatin C水平
• 4.2.1.2 糖尿病人的Cat S和Cystatin C水平
• 4.2.2 讨论
• 4.3 小鼠Cat R基因的表达分布和转录起始位点的确定
• 4.3.1 小鼠Cat R mRNA特异表达于胎盘
• 4.3.2 小鼠Cat R mRNA的转录起始
• 5 第一部分总结
• 6 参考文献
• 第二部分 棉铃虫组织蛋白酶L在棉铃虫幼虫蜕皮和脂肪体解离中的作用
• 1 综述
• 1.1 昆虫半胱氨酸蛋白酶在胚胎发育中的作用
• 1.1.1 在卵黄蛋白降解中的作用
• 1.1.2 参与发育中卵巢的重建
• 1.2 昆虫半胱氨酸蛋白酶在变态发育中的作用
• 1.2.1 参与变态发育期间幼虫组织的解离
• 1.2.2 参与成虫盘的分化及脑基膜降解
• 2 实验内容与研究意义
• 2.1 研究背景与意义
• 2.1.1 棉龄虫Cat L在昆虫蜕皮中的功能研究
• 2.1.2 棉铃虫Cat L在脂肪体解离中的功能研究
• 2.2 实验流程
• 3 材料与方法
• 3.1 棉铃虫的饲养和基本操作
• 3.2 组织和血淋巴的收集
• 3.3 蛋白的制备
• 3.4 Cathepsins活性和抑制分析
• 3.5 PCR、RACE与相应引物
• 3.5.1 用于中间片段扩增的PCR条件与引物
• 3.5.2 RACE cDNA第一链合成
• 3.5.3 用于RACE 5’与3’扩增的PCR条件与引物
• 3.5.4 用于原和表达的引物
• 3.5.5 用于竞争性RT-PCR的PCR条件与引物
• 3.6 DNA胶回收
• 3.7 克隆的基本方法
• 3.7.1 连接反应
• 3.7.2 感受态细胞制备
• 3.7.3 转化
• 3.8 质粒DNA小量抽提（煮沸法）
• 3.9 质粒DNA大量抽提（碱裂解法）
• 3.10 竞争性RT-PCR
• 3.10.1 截短的Har-CL（T-HarCL）产生
• 3.10.2 反转录
• 3.10.3 PCR及Southern blotting
• 3.11 原核表达及纯化
• 3.11.1 原核表达质粒的构建
• 3.11.2 小规模诱导表达
• 3.11.3 大规模培养并制样
• 3.11.4 Ni柱纯化
• 3.12 抗体的制备
• 3.12.1 免疫动物
• 3.12.2 抗血清的收集
• 3.13 ELISA测抗体效价（采用间接法）
• 3.14 Western blot
• 3.15 整体免疫组化
• 3.16 蜕皮激素含量的测定
• 3.17 E64d和CLIK148的注射
• 3.18 数据的统计和分析
• 4 结果与讨论
• 4.1 棉龄虫Cat L在昆虫蜕皮中的功能研究
• 4.1.1 结果
• 4.1.1.1 在不同幼虫期Cathepsin活性的分析
• 4.1.1.2 全长Har-CL cDNA的分离
• 4.1.1.3 Har-CL cDNA结构
• 4.1.1.4 Har-CL蛋白的重组表达与抗体制备
• 4.1.1.5 Har-CL的组织分布
• 4.1.1.6 Har-CL在幼虫发育期间的表达
• 4.1.1.7 血淋巴Har-CL蛋白和蜕皮激素效价在幼虫发育期间的变化
• 4.1.1.8 Cat L对5到6龄蜕皮的作用
• 4.1.2 讨论
• 4.2 棉铃虫Cat L在脂肪体解离中的作用
• 4.2.1 结果
• 4.2.1.1 脂肪体中的Cathepsins活性变化
• 4.2.1.2 Har-CLmRNA和蛋白在滞育型和非滞育型脂肪体中的表达
• 4.2.1.3 Har-CL在滞育型和非滞育型脂肪体中的定位
• 4.2.1.4 Har-CL在滞育和非滞育型血淋巴中的浓度和活性变化
• 4.2.2 讨论
• 5 结论
• 6 参考文献
• 致谢
• 博士期间发表和待发表的论文
• 附录