小麦颖果筛分子和果皮发育中的细胞编程性死亡研究

论文摘要

小麦颖果腹部韧皮部筛分子是光合同化物向颖果转运的主要通道。在筛分子发育过程中,细胞器被选择性的降解。其中细胞核、核糖体、高尔基体和液泡等细胞器逐渐消失,只剩下完整的细胞膜和堆叠的内质网、体积变大了的线粒体等少量细胞器,最后形成具有养分运输功能的成熟筛分子,但筛分子仍然是活细胞。前人推测筛分子发育可能经历了一个类似细胞编程性死亡（PCD）的过程,但没有充分的证据。筛分子发育过程中,细胞核DNA是否发生了有规律的断裂?液泡破裂是在何时发生的?有何作用?细胞器降解为何能够停止?等等。上述问题均未有获得合理的解释。禾谷类作物果皮细胞的典型特征是细胞质少,内有一个大液泡,且在发育过程中逐渐衰退成为只有细胞壁的空细胞。早期的研究发现果皮发育伴随着淀粉积累的动态变化,证明果皮不仅是一个保护胚珠及种子的结构,可能同时也是营养物质中间转运以及暂时积累的场所。果皮细胞的发育可能经历了一个PCD过程,但PCD中的细胞学事件未见详细报道,同时果皮淀粉积累与果皮细胞PCD之间的关系也不清楚。本研究将经典的PCD检测方法应用于筛分子和果皮发育过程中,试图解决上述一些悬而未决的问题。主要结果如下:1.筛分子发育过程中的TUNEL标记和吖啶橙/碘化丙啶荧光染色结果显示,最早在开花3 d（3 DAF）检测到筛分子细胞核呈TUNEL阳性反应。在4 DAF时,细胞核变得模糊,其阳性检出率增加;随后,阳性反应消失。在6 DAF时,细胞核消失,筛分子成熟。上述结果表明筛分子发育过程中细胞核被降解,核DNA发生了断裂,可能是一个PCD过程。2.筛分子发育过程中的电镜观察结果表明:筛分子发育是一个PCD过程,但该过程并没有导致细胞死亡,而是中途停止并形成具有养分运输能力的功能细胞。具体表现在:细胞核衰退、染色质凝集并趋边化,进而染色质逐渐降解,但核膜却一直保持原来椭圆形状直到最后消失。细胞出现液泡化,且在细胞核解体后,液泡化程度达到最高。液泡中含有电子染色深的物质,可选择性的降解细胞器。在液泡即将破裂时,电子染色深的物质消失,并且液泡破裂对残存的细胞器没有影响,说明即将破裂的液泡中无水解酶活性。同时还观察到了线粒体被单层内质网膜包裹并降解等细胞学事件,最后残存的线粒体和质体等细胞器沿细胞壁排列。在成熟筛分子中发现细胞膜内陷形成内吞泡结构,内含电子染色深的物质,并观察到内吞泡的膜破裂和释放内含物质,可能是筛分子正通过质外体途径进行养分横向运输。4.Ca2+-ATPase定位显示,在筛分子整个发育过程中,细胞壁和液泡膜上无酶的活性产物,但细胞膜上一直存在。在3 DAF时细胞膜上的酶活性产物分布最少,此时筛分子细胞核DNA刚开始断裂,说明Ca2+-ATPase可能与细胞核DNA片段化有关。5.果皮发育过程中的TUNEL标记和吖啶橙/碘化丙啶荧光染色结果显示,在开花前5 d出现呈阳性反应的细胞核;2-7 DAF时,阳性检出率逐渐降低。从4 DAF开始,果皮细胞核逐渐减少,15 DAF时细胞核消失。上述结果说明果皮细胞发育过程中细胞核被降解,且核DNA出现片段化,可能是一PCD过程。6.果皮细胞发育中的电镜观察结果表明:从2 DAF开始,细胞核出现显著的衰退特征,如核异染色质凝集、核聚缩、核变形等。随后异染色质逐渐消失,到15DAF时细胞核完全降解。伴随核衰退,还观察到线粒体降解、细胞液泡化和液泡膜破裂等细胞学事件。说明果皮细胞发育是PCD过程,且PCD启动早,持续时间长,是一个延迟的过程。在PCD过程中,有淀粉颗粒在淀粉质体（开花前）或叶绿体（开花后）中合成并暂时贮藏。贮藏的淀粉颗粒在果皮细胞发育后期不断降解,为果皮细胞生存提供能量。当贮藏的淀粉消耗尽时,果皮细胞因能量缺乏而快速死亡,说明PCD启动受基因控制,但PCD的执行受细胞能量供应的影响,充足的能量供应能延缓细胞PCD。另外,正常线粒体的存在是果皮细胞存活的必要条件。果皮细胞除了保护作用外,还具有合成、储存、降解淀粉和养分转运功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 筛分子发育过程中的细胞编程性死亡研究
• 1 前言
• 1.1 韧皮部发育研究进展
• 1.1.1 筛分子发育研究进展
• 1.1.1.1 细胞壁
• 1.1.1.2 细胞核
• 1.1.1.3 内质网
• 1.1.1.4 线粒体
• 1.1.1.5 胞间连丝
• 1.1.1.6 液泡
• 1.1.2 伴胞发育研究进展
• 1.1.2.1 普通伴胞
• 1.1.2.2 中间细胞
• 1.1.3 韧皮部薄壁细胞发育研究进展
• 1.1.4 筛分子发育的超微细胞化学研究
• 1.2 细胞编程性死亡研究进展
• 1.2.1 细胞编程性死亡的概念
• 1.2.2 动物和植物细胞编程性死亡的区别
• 1.2.3 植物细胞编程性死亡的发生方式和典型特征
• 1.2.4 线粒体、液泡和部分信号物质在植物细胞编程性死亡中的作用
• 2+信号在细胞编程性死亡中的作用'>1.2.4.1 Ca²⁺信号在细胞编程性死亡中的作用
• 1.2.4.2 线粒体在细胞编程性死亡相关信号传递中的作用
• 1.2.4.3 液泡在细胞编程性死亡相关信号传递中的作用
• 1.2.4.4 植物细胞编程性死亡相关信号物质之间的关系
• 1.2.5 细胞编程性死亡检测方法及评价
• 1.2.5.1 常规电镜检测（TEM）
• 1.2.5.2 TUNEL检测
• 1.2.5.3 DNA Ladder电泳检测
• 1.2.5.4 Hoechst 33258/PI荧光复染色
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料种植与取样
• 2.2 方法
• 2.2.1 电镜观察
• 2.2.1.1 常规电镜制样
• 2+-ATPase定位'>2.2.1.2 Ca²⁺-ATPase定位
• 2.2.2 光镜观察
• 2.2.2.1 吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）荧光复色
• 2.2.2.2 TUREL标记
• 2.2.3 数据统计
• 2.2.3.1 小麦颖果原生韧皮部筛分子与后生韧皮部筛分子细胞壁厚度的测量
• 2.2.3.2 后生韧皮部筛分子发育过程中细胞壁厚度的测量
• 2.2.3.3 不同发育时期的后生韧皮部筛分子中出现TUNEL阳性反应细胞核的数量
• 2.2.3.4 筛分子中液泡的统计
• 2.2.3.5 具有内吞泡结构的筛分子数量统计
• 3 结果与分析
• 3.1 吖啶橙/碘化丙啶染色检测细胞核的形态变化
• 3.2 TUNEL检测细胞核的DNA断裂
• 3.3 电镜检测筛分子发育中的超微结构变化
• 3.3.1 原生韧皮部筛分子的发育
• 3.3.2 后生韧皮部筛分子的发育
• 3.3.2.1 后生韧皮部筛分子中细胞核的形态变化
• 3.3.2.2 后生韧皮部筛分子中液泡的形态变化
• 3.3.2.3 后生韧皮部筛分子中线粒体和其它部分细胞结构的形态变化
• 3.3.2.4 后生韧皮部筛分子中细胞膜的形态变化
• 2+-ATPase的定位'>3.4 后生韧皮部筛分子发育过程中Ca²⁺-ATPase的定位
• 4 讨论
• 4.1 筛分子发育是一个特殊的细胞编程性死亡过程
• 4.2 筛分子细胞编程性死亡停止的可能原因
• 4.3 筛分子细胞内含物的降解
• 4.4 筛分子物质运输方式
• 2+-ATPase与筛分子细胞编程性死亡的关系'>4.5 Ca²⁺-ATPase与筛分子细胞编程性死亡的关系
• 4.6 筛分子细胞编程性死亡模式
• 第二章 小麦果皮细胞编程性死亡与淀粉积累的关系
• 1 前言
• 1.1 果皮细胞发育与细胞编程性死亡
• 1.2 果皮细胞的结构和功能
• 1.3 果皮细胞发育过程中淀粉积累动态的研究
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料种植与取样
• 2.2 方法
• 2.2.1 常规电镜制样
• 2.2.2 荧光染色观察
• 2.2.2.1 吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）荧光复染色
• 2.2.2.2 TUNEL标记
• 2.2.3 数据统计
• 2.2.3.1 果皮发育过程中淀粉质体和淀粉颗粒的计数和测量
• 2.2.3.2 果皮细胞中叶绿体与淀粉质体的比例
• 3 结果与分析
• 3.1 果皮发育过程中的细胞编程性死亡检测
• 3.1.1 TUNEL标记检测细胞核DNA断裂
• 3.1.2 吖啶橙/碘化丙啶染色检测细胞核的形态变化
• 3.1.3 电镜检测果皮细胞发育过程中超微结构的变化
• 3.2 果皮细胞中淀粉积累动态观察
• 3.2.1 果皮中淀粉积累的光镜检测
• 3.2.2 果皮发育中的淀粉积累动态
• 3.2.3 淀粉积累的超微结构观察
• 4 讨论
• 4.1 果皮细胞发育中细胞编程性死亡与淀粉积累的关系
• 4.2 果皮淀粉积累与胚乳淀粉消长的关系
• 4.3 果皮细胞中淀粉解体物输入胚乳的可能途径和方式
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 论文图版
• 附录2 在读期间发表和拟发表的文章