食源假单胞菌群体感应信号分子的产生及其对食品腐败的影响

论文摘要

细菌细胞产生信号分子并释放到环境中去，当环境中信号分子的浓度达到某一阈值后，细菌细胞开启细胞密度依赖的特定基因的表达机制，这一现象被称为“群体感应（quorum sensing，简称QS）”。N-酰基-高丝氨酸内酯类（AHLs）化合物是革兰氏阴性菌群体感应系统中最典型的一类信号分子。细菌细胞通过产生AHL进行交流信息，协调群体行为，调控某些特定的生理性状的表达，这一研究领域日益受到人们的关注。假单胞菌（Pseudomonas）是导致高蛋白食品腐败的重要细菌。研究表明，嗜铁素的产生和蛋白酶活性是假单胞菌最重要的致腐因素，导致腐败食品特有的金属光泽和腐臭味。近年来对人类条件致病菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）以及植物致病菌的研究表明，嗜铁素产生及蛋白酶活性是由AHL调控的。但目前国内外对食源假单胞菌群体感应信号分子的产生及其与嗜铁素产生、蛋白酶活性之间的关系未见报道。本文对食源假单胞菌N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子的产生及其对食品腐败的影响进行了研究。为进一步确定群体感应机制在食品腐败中的作用，以期为构建基于干扰腐败细菌群体感应系统作为新靶点的食品防腐保鲜策略提供理论依据。主要结果如下：1利用细菌生物感应器Chromobacterium violaceum CVO26和Agrobacteriumtumefaciens A136（pCF218／pCF372）建立了琼脂扩散法（平行画线法、报告平板法）、细菌生物感应器与薄层层析相结合（TLC-Biosensor）以及β-半乳糖苷酶活法检测AHL的生物学检测方法，该法能够简单、快速检测AHL。2根据AHL信号分子的典型特征，建立HPLC／MS法检测、鉴定AHL信号分子的方法。结果表明，在没有标准品的条件下，HPLC／MS是一种有效鉴定AHL信号分子的方法，检测的灵敏度明显高于经典的细菌生物感应器检测AHLs的方法：3通过生理生化鉴定与16S rDNA序列分析相结合的方法，对源于食品的3株革兰氏阴性菌FML05-1、FML05-2、FML05-3进行鉴定，菌株FML05-1、FML05-2为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），FML05-3为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）；4利用细菌生物感应器对3株菌AHL产生情况进行检测，结果表明3株菌均产生AHLs信号分子。为进一步确定3株菌所产生的AHL的种类，对3株菌的培养上清进行TLC-biosensor分析，发现FML05-1和FML05-2至少产生两种AHLs分子，主要信号分子是N-3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯（N-3-oxo-C8-HSL），而FML05-3没有检测到任何斑点；5利用HPLC／MS方法对3株菌产生的AHLs分子进一步鉴定，结果表明，FML05-1菌株产生N-3-oxo-C8-HSL和N-3-oxo-C10-HSL，FML05-2菌株产生N-3-oxo-C10-HSL、N-3-oxo-C8-HSL、C6-HSL和C4-HSL，而FML05-3菌株产生C6-HSL和C4-HSL。由此可见，利用TLC-biosensor方法没有得到鉴定的AHL分子，HPLC／MS方法得到鉴定；6对菌株在生长过程中所产生的AHLs的活性变化进行研究，发现随着菌体密度的增加，AHLs浓度也随之增加，在菌体生长至对数中末期或稳定期时达到最大，随之AHLs的浓度开始下降。同时其培养液中的pH值呈现上升的趋势。同时研究了pH值条件对AHL稳定性的影响，结果发现，在碱性条件下AHL的稳定性下降。当pH值为8.5，反应时间为8h时，AHLs活性降至约为原来的50％。因此，菌体生长后期AHL活性下降与环境中pH值的升高有关；7研究了不同温度及碳源对食源假单胞菌AHLs产生的影响。结果表明，在25℃条件下，菌株FML05-1和FML05-2，产生长链和短链两种AHL信号分子，而在4℃条件下，主要产生长链AHL分子。而且在不同碳源（葡萄糖，果糖，木糖，麦芽糖等）的AB培养基中生长，所产生的AHLs分子种类也不相同。表明在不同的环境条件（碳源及温度）下假单胞菌产生不同种类的AHLs；8对3株腐败菌的致腐因素进行检测，发现FML05-2具有很强的蛋白水解活性，并且在脱脂牛奶中生长还产生大量的嗜铁素，但在LB中生长时不产生嗜铁素；菌株FML05-1蛋白水解活性相对FML05-2较弱，在LB及脱脂牛奶中生长均不产生嗜铁素，而菌株FML05-3不表达上述2种致腐因素；9利用产aiiA蛋白酶的菌株对假单胞菌FML05-2所产生的AHL分子进行降解，发现FML05-2对脱脂牛奶的致腐作用明显减弱，嗜铁素的产量与蛋白酶活性明显下降。说明FML05-2嗜铁素的产生和蛋白酶活性与AHL的产生及浓度有关。为建立以干扰腐败细菌群体感应系统为靶点的食品防腐保鲜新策略提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写符号
• 表格索引
• 图形索引
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 细菌的群体感应系统及其调控机制
• 1.1 革兰氏阴性菌的群体感应系统
• 1.1.1 系统构成及其调控机制
• 1.1.2 信号分子种类与检测方法
• 1.2 革兰氏阳性菌的群体感应调控系统
• 1.3 细菌种间通讯的群体感应系统
• 1.3.1 AI-2的感应机制
• 1.3.2 AI-2的生物合成途径
• 2 QS系统所调控的生物学功能
• 2.1 AHL所调控的生物学功能
• 2.2 AI-2所调控的生物学功能
• 3 干扰QS系统的策略与技术
• 3.1 使用AHL信号分子降解酶
• 3.2 利用AHL信号分子的类似物干扰基于AHL的QS系统
• 3.3 AHL与免疫
• 3.4 AI-2介导的群体感应系统干扰技术
• 3.5 研究最新进展
• 4 假单胞菌QS系统的构成及其作用
• 5 群体感应与食品腐败的关系
• 6 本研究的主要内容及意义
• 参考文献
• 第二章 AHL类信号分子检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、质粒与培养条件
• 1.2 试剂与设备
• 1.2.1 主要试剂及溶液
• 1.2.2 设备
• 1.3 报告菌平板法对报告菌检测能力的确证
• 1.4 平行画线法检测AHLs
• 1.5 AHLs的粗提液的制备
• 1.6 报告平板打孔法检测AHLs
• 1.7 TLC-Biosensor检测
• 1.8 β-半乳糖苷酶法检测AHLs
• 1.9 HPLC/MS法检测与鉴定AHL分子
• 2 结果与分析
• 2.1 AMLs信号分子TLC-Biosensor检测方法的建立
• 2.2 β-半乳糖苷酶活法检测AHLs
• 2.3 HPLC/MS方法检测和鉴定AHLs
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 食源假单胞菌AHLs信号分子的产生与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 腐败细菌的分离
• 1.2 菌株、质粒及培养条件
• 1.3 主要试剂与设备
• 1.4 平行划线法检测AHLs
• 1.5 AHLs的粗提液的制备
• 1.6 报告平板打孔法检测AHLs
• 1.7 总DNA的提取
• 1.8 PCR扩增与测序
• 1.9 系统发育树的构建
• 1.10 TLC-Biosensor检测
• 1.11 HPLC/MS法检测与鉴定AHL分子
• 1.12 用于HPLC/MS检测的样品处理
• 1.13 生长曲线的制作
• 1.14 生长过程中AHL浓度变化检测
• 2 结果与分析
• 2.1 特定食品腐败菌的分离鉴定及其腐败特征
• 2.1.1 特定腐败菌株的分离及其腐败特征
• 2.1.2 16Sr DNA序列分析与系统发育树的构建
• 2.1.3 特征腐败菌株的生理生化特性
• 2.2 食源假单胞菌AHLs信号分子的检测
• 2.3 食源假单胞菌AHLs信号分子HPLC/MS法鉴定
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 食源假单胞菌AHLs信号分子产生规律及其影响因素
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、质粒及培养条件
• 1.2 试剂与器材
• 1.3 β-半乳糖昔酶法检测AHLs
• 1.4 TLC-Biosensor检测
• 1.5 温度对AHL产生的影晌
• 1.6 不同碳源对AHLs产生的影晌
• 1.7 不同pH值对AHL稳定性的影晌
• 2 结果与分析
• 2.1 温度对AHL产生的影晌
• 2.2 碳源对AHL产生的影晌
• 2.3 pH对AHLs稳定性的影晌
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 食源假单胞菌AHLs产生对食品腐败的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、质粒与培养条件
• 1.2 主要试剂与设备
• 1.3 食品腐败相关因子的检测
• 1.3.1 嗜铁素检测
• 1.3.2 蛋白酶活性检测
• 1.4 AHL粗提液的制备
• 1.5 荧光假单胞菌P3（pME6863）降解AHL的验证
• 1.6 AHL的降解对腐败过程的影晌
• 2 结果与分析
• 2.1 食品腐败因子的检测
• 2.1.1 嗜铁素的产生
• 2.1.2 蛋白水解酶活性检测
• 2.2 荧光假单胞菌P3（pME6863）对AHLs的降解作用
• 2.3 AHLs的降解对腐败过程的影响
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 全文结论
• 论文创新点
• 致谢
• 博士研究生期间在科学技术期刊上发表的论文
• 附录一
• 附录二
• 附录三