携带PRRS病毒ORF5基因胸膜肺炎放线杆菌载体的构建及特性鉴定

论文摘要

胸膜肺炎放线杆菌（APP）是引起猪传染性胸膜肺炎的呼吸道病原细菌；猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）可引起一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的烈性传染病。这两种病原均为当前公认的危害现代养猪业的重大传染性病原。本文在APP基因缺失突变致弱菌株构建成功的基础上，将PRRSV基因组中编码保护性抗原的ORF5基因片段插入APP基因缺失区，构建携带异源基因的APP细菌载体。本试验结果将为研制可同时预防APP和PRRSV这两种病原感染的细菌减毒活疫苗奠定坚实的基础。首先利用原核表达系统对PRRSV-ORF5基因片段进行表达分析以鉴定可在细菌中表达的抗原表位。利用PCR方法分别扩增ORF5基因缺失信号肽的D片段、缺失信号肽和跨膜区的L片段、缺失信号肽的5’端N片段和缺失跨膜区的3’端C片段，经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达，结果显示未缺失跨膜区的D片段未见表达产物，而L片段、N片段和C片段分别表达大小约为33 kDa、25 kDa和29 kDa的融合蛋白。Western blotting检测结果显示L片段表达蛋白可与PRRSV阳性血清发生结合反应，C片段反应性稍弱，而N片段未出现阳性反应。结果证实含有跨膜区的ORF5基因片段不能良好表达，C端在与GP5抗体结合方面具有重要作用。在ORF5基因不同功能区表达分析的基础上将ORF5基因片段（L）分别插入apxIA或apxIC基因缺失区以构建不同的突变菌株。利用双酶切分别自重组质粒pTAU、pT-ORF5L、pTChlr和pTAD中切出1.8 kb的AU、348 bp的ORF5L、1.1 kb的Chlr和1.7 kb的AD基因片段，将上述基因片段串联并插入pUC19的相应酶切位点，构建转移载体pUIA-L-Chlr。用同样的方法分别自重组质粒pTCU、pT-ORF5L、pTChl1和pTCL中切出2.2 kb的CU、348 bp的ORF5L、1.1 kb的Chlr和1.8 kb的CL基因片段，将上述基因片段串联并插入pUC19的相应酶切位点，构建转移载体pUIC-L-Chlr。将两种转移载体经电转化分别导入胸膜肺炎放线杆菌血清10型野生菌株中进行同源重组，筛选获得两种突变菌株。利用PCR和Southern Blotting对突变菌株进行了鉴定，并对突变菌株生物学特性进行了分析。结果表明，ORF5基因片段已成功导入突变菌株中，两种突变菌株均可正常增殖，连续传代后插入的Chlr和ORF5基因片段可稳定遗传，与母源菌株相比毒力降低100倍以上，将突变菌株免疫小鼠后利用ELISA检测小鼠血清中GP5抗体水平，证实随免疫次数增加GP5抗体呈现逐步升高的趋势，提示突变菌株中携带的ORF5基因片段具有表达能力，同时ELISA检测结果显示apxIA基因缺失突变菌株的GP5抗体水平明显高于apxIC基因缺失突变菌株GP5抗体水平。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 插图与附表清单
• 缩略词表
• 第一章 引言
• 1.1 国内外研究现状
• 1.2 研究的目的与意义
• 1.3 研究内容与技术路线
• 1.4 研究目标
• 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因不同编码区的表达和反应原性鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果与分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 携带PRRS病毒ORF5基因胸膜肺炎放线杆菌载体的构建及特性鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 结论
• 第五章 文献综述
• 5.1 囊膜糖蛋白GP5的结构与功能
• 5.2 胸膜肺炎放线杆菌疫苗
• 第六章 附录
• 参考文献
• 致谢