人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的克隆、表达与纯化

论文摘要

氨酰-tRNA合成酶是有机体生命进化过程中最早出现的一类蛋白质。近年来研究表明,氨酰-tRNA合成酶除了通过两步特异性反应催化氨基酸与它同源的tRNA相结合外,还参与基因表达调控、调节rRNA合成、RNA剪切细胞因子和抑制细胞凋亡等许多的生命活动。本研究的目的是获得人线粒体色氨酰-tRNA合成酶,并用体外转录的人线粒体tRNATrp对其活力进行测定。为进一步研究该酶的结构、功能以及氨酰-tRNA合成酶的种属特异性氨酰化奠定了基础。采用RT-PCR法从人乳腺癌细胞（MDA-MB-435S）总RNA中获得编码人线粒体色氨酰-tRNA合成酶（hmtTrpRS）的全序列,并将此片断连接到克隆载体pMD18-T中,构建了克隆载体pMD18-hmtTrpRS,然后经过限制性内切酶NedⅠ和EcoRⅠ双酶切,酶切产物连接到表达载体pET-24a（+）中,经过抗性筛选、分子量大小比较、双酶切鉴定和PCR鉴定等多种方法验证,得到了人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的高表达质粒pET-24a（+）-hmt TrpRS。筛选出阳性重组子转化大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL诱导表达。分析了异丙基硫代p—D—半乳糖苷（IPTG）诱导浓度、诱导时间和诱导温度对融合蛋白表达的影响。结果表明诱导蛋白表达较合适条件为IPTG浓度为0.1 mmol/L,30℃诱导4h,所表达的蛋白质其分子量与理论值38 KDa相符。在特异性的Ni2+亲和柱的帮助下,分别纯化了以包涵体和可溶蛋白形式存在的目的蛋白,获得了纯度均达到95%以上的含6个His标记的人线粒体色氨酰-tRNA合成酶融合蛋白。通过两步PCR法成功构建了人线粒体tRNATrp基因,并成功进行了转录,制备了人线粒体tRNATrp。测定了纯化可溶蛋白得到的人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的氨酰化活力。利用lineweaver-Burk作图法计算出人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的动力学常数Km为1.08μmol/L,kcat为0.02S-1,蛋白纯品的比活为4411.18 U/mg综上所述,本研究从人乳腺癌细胞（MDA-MB-435S）中克隆得到了人线粒体色氨酰-tRNA合成酶基因,成功构建了表达载体pET-24a（+）-hmt TrpRS,并在大肠杆菌中获得了高效表达。进一步通过Ni亲和柱层析得到蛋白纯品后,并以体外转录得到的人线粒体tRNATrp为底物,对人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的氨酰化活力进行了测定,取得较理想结果。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 一 绪言
• 1 氨酰-tRNA合成酶的研究
• 1.1 氨酰-tRNA合成酶的结构
• 1.2 氨酰-tRNA合成酶的功能
• 1.3 氨酰-tRNA合成酶的起源
• 1.4 氨酰-tRNA合成酶的克隆、表达与纯化研究
• 2 色氨酰-tRNA合成酶的研究
• 2.1 原核色氨酰-tRNA合成酶的研究
• 2.2 真核色氨酰-tRNA合成酶的研究
• 2.3 线粒体氨酰-tRNA合成酶的研究
• 3 研究的背景、目的意义、研究内容和技术路线
• 3.1 研究的背景
• 3.2 本研究的项目依托与研究的意义
• 3.3 主要研究内容
• 3.4 主要技术路线
• 二 人线粒体色氨酰-tRNA合成酶基因表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 药品与试剂
• 1.1.1 材料与试剂
• 1.1.2 主要实验仪器
• 1.1.3 常用试剂配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的基因片断的制备
• 1.2.2 pMD18-hmtTrpRS克隆载体的构建与鉴定
• 1.2.3 pET-24a（+）-hmtTrpRS表达载体的构建与鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的基因的获得
• 2.1.1 人的乳腺癌细胞（MDA-MB-435S）总RNA的提取
• 2.1.2 RT-PCR扩增人线粒体色氨酰-tRNA合成酶片段
• 2.1.3 pMD18-hmtTrpRS克隆载体的构建与鉴定
• 2.1.4 pET-24a（+）-hmtTrpRS表达载体的构建与鉴定
• 3 讨论
• 3.1 采取亚克隆的策略构建融合表达载体pET-24a（+）-hmtTrpRS
• 3.2 人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的原核表达系统
• 三 人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的表达与纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 药品与试剂
• 1.1.1 材料与试剂
• 1.1.2 主要实验仪器
• 1.1.3 常用试剂配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的表达
• 1.2.2 人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的纯化
• 2 结果与分析
• 2.1 人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的表达
• 2.1.1 IPTG浓度对人线粒体色氨酰-tRNA合成酶基因表达的影响
• 2.1.2 诱导时间对人线粒体色氨酰-tRNA合成酶基因表达的影响
• 2.1.3 诱导温度对人线粒体色氨酰-tRNA合成酶基因表达的影响
• 2.1.4 培养基对人线粒体色氨酰-tRNA合成酶基因表达的影响
• 2.2 人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的纯化鉴定
• 2.2.1 包涵体的纯化
• 2.2.2 可溶蛋白的纯化
• 3 讨论
• 3.1 诱导条件对人线粒体色氨酰-tRNA合成酶表达的影响
• 3.2 包涵体的形成
• 3.3 金属螯合亲和层析对人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的纯化
• 四 人线粒体色氨酰-tRNA合成酶的氨酰化活力测定
• 1 材料与方法
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 人线粒体tRNATrp的制备
• 1.2.2 氨酰化反应测定人线粒体色氨酰-tRNA合成酶动力学常数
• 2 结果与分析
• 2.1 人线粒体tRNATrp的制备
• 2.1.1 两步PCR扩增
• 2.1.2 人线粒体tRNATrp的酶切体外转录
• 2.2 氨酰化反应测定人线粒体色氨酰-tRNA合成酶动力学常数
• 3 讨论
• 五 结论
• 六 展望
• 参考文献
• 附录A
• 附录B
• 附录C
• 致谢