论文摘要
研究目的:炎症是一种生存必需的基础生理过程,但它同时又是人类疾病的一大诱因。近期的研究表明迷走神经能够通过胆碱能抗炎通路来调节免疫反应,抑制炎症。乙酰胆碱是迷走神经的重要神经递质,它能够通过α7尼古丁乙酰胆碱受体（α7-nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR）抑制巨噬细胞中炎症因子的释放。尼古丁作为一种选择性更高的激动剂,可以更有效的抑制炎症因子的产生。已有越来越多的研究证明α7nAChR在免疫调节中起关键作用,但是α7nAChR激活后的下游信号转导通路却并未被研究透彻。α7nAChR激动剂尼古丁和乙酰胆碱能够抑制内毒素诱导的巨噬细胞炎症因子的释放,但是却不影响这些炎症因子的mRNA水平,提示我们尼古丁的抑炎作用,发生于转录后水平。而我们知道miRNA这样一种内源性的小分子非编码RNA对靶mRNA的抑制作用也发生在转录后水平。因此我们设想:miRNAs可能在胆碱能抗炎中扮演了重要的角色,本课题的研究目的在于探讨是否存在作用于胆碱能抗炎通路的miRNAs,并对其作用机制及加强胆碱能抗炎的疗效进行观察。研究方法:本研究以内毒素诱导炎症为主要模型,在整体动物和巨噬细胞模型上,利用整体动物学实验方法和分子生物学手段,研究参与胆碱能抗炎过程的miRNAs （已经筛选出miR-124a作为研究对象）。在细胞水平上,研究miR-124a对炎症因子IL-6与TNF-α表达的影响;在动物整体水平上,通过研究miR-124a过表达以及缺失情况下对炎性休克的影响,进一步证实miR-124a的抗炎作用;并使用分子生物学手段初步探讨miR-124a抗炎作用的机制。结果:1.在RAW264.7巨噬细胞建立尼古丁抗炎模型,发现尼古丁抗炎特点——降低IL-6蛋白水平与mRNA水平的表达,仅降低TNF-α蛋白水平的表达却不影响TNF-αmRNA水平的表达;尼古丁激活α7nAChR后能够明显上调使miR-124a的表达量;通过时效实验我们观察到,尼古丁作用后3h,miR-124a表达开始上调,早于尼古丁对炎症因子IL-6与TNF-α的抑制作用;而miR-124a过表达可以剂量依赖的降低IL-6与TNF-α的蛋白水平,也可剂量依赖的下调IL-6 mRNA水平,但是不影响TNF-α的mRNA水平,与尼古丁抗炎的特点相符;miR-124a knockdown后可以观察到尼古丁对IL-6与TNF-α蛋白水平的抑制作用均有减弱,但是仅减弱尼古丁对IL-6 mRNA的抑制而不影响TNF-α的水平。2.在动物整体水平,我们摸索了内毒素致Blab/c小鼠感染性休克的剂量与尼古丁的有效抗休克剂量;并观察到尼古丁抗炎时,小鼠心、脾、脑与血清中miR-124a的表达均有明显的上调;而在整体水平使miR-124a过表达可以显著延长内毒素血症小鼠的生存时间;miR-124a整体水平knockdown后尼古丁抗休克作用减弱。3.荧光素酶报告基因结果证明miR-124a不能直接作用于IL-6和TNF-ααmRNA的3’-UTR,但是可以直接作用于STAT3 mRNA的3’-UTR;在RAW细胞中miR-124a过表达能够抑制STAT3蛋白表达,而且能够通过抑制STAT3蛋白表达而抑制内毒素诱导的STAT3磷酸化增加;通过观察尼古丁对STAT3与p-STAT3蛋白表达时效影响,发现LPS作用3h后p-STAT3表达显著上调,而尼古丁能够降低STAT3蛋白表达及其磷酸化,而不影响STAT3 mRNA的水平,说明尼古丁对STAT3的调节发生在转录后水平;STAT3 knockdown使LPS诱导的IL-6的蛋白水平与mRNA的水平均被抑制,而对TNF-α蛋白水平和mRNA水平均无影响;STAT3 knockout细胞中LPS诱导炎症后IL-6蛋白和mRNA水平明显降低,但上清TNF-α蛋白水平未能检出。STAT3 knockdown后miR-124a抑制IL-6蛋白的作用减弱,而不影响TNF-α蛋白水平。4.尼古丁可以降低LPS诱导的TNF-α蛋白稳定性,miR-124a mimics同样能够降低TNF-α蛋白稳定性。结论:尼古丁激活α7nAChR后上调miR-124a的表达,而miR-124a通过抑制STAT3的蛋白水平及其活化水平而减少IL-6 mRNA和蛋白的生成,miR-124a对TNF-α的抑制通过STAT3外的机制,有待进一步研究。
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