银杏黄酮相关基因的克隆及转化

论文摘要

银杏树是一种古代的珍贵树种,有“活化石”之称,属我国特产植物资源。银杏叶在中医上认为可以活血化疲、通脉疏络。银杏因富含类黄酮物质而具有重要的药用价值。为了深入研究银杏黄酮类化合物生物合成途径,并为今后利用基因工程方法提高银杏中黄酮类化合物的含量打下基础,本文首次克隆并研究了银杏黄酮类化合物生物合成途径上游的苯丙酸途径中的肉桂酸-4-羟化酶的基因（GbC4H）以及与黄酮类化合物合成途径并行的木质素合成途径中的香豆酸-3-羟化酶的基因（GbC3H）。GbC4H和GbC3H以及本实验室已克隆的黄酮类化合物合成途径中的关键酶基因查尔酮合成酶基因（GbCHS）和黄酮醇合成酶基因（GbFLS）通过转化模式植物烟草以验证它们对黄酮类化合物合成的影响,同时转化银杏愈伤组织,以提高银杏愈伤组织中黄酮类化合物的含量。此外,考虑到转录因子在银杏黄酮合成中的重要作用,从白菜中克隆了WRKY转录因子的基因（BcWRKY）,同时也进行了转化。肉桂酸-4-羟化酶催化肉桂酸羟基化并得到产物香豆酸,是苯丙酸途径中的第二个关键步骤。本文采用RACE和PCR方法,获得了GbC4H基因的全长cDNA序列及其基因组序列,两者之间的序列比对结果表明,GbC4H基因含有两个外显子和一个内含子。推导的GbC4H蛋白和其它植物来源的C4H蛋白具有较高的相似性。C4H系统发生树分析结果表明,GbC4H与裸子植物的C4H具有更近的进化关系。Southern blot分析表明,GbC4H基因属于一个多基因家族。RT-PCR分析表明,GbC4H基因在根、茎和叶中的表达水平不同,在根中表达水平最高,并能受到盐、甘露醇、冷、干旱等环境胁迫的诱导。GbC4H已被构建到植物表达载体p1304中并用于植物的遗传转化,并且已经得到PCR检测为阳性的烟草植株。香豆酸-3-羟化酶（C3H）位于肉桂酸-4-羟化酶下游,是木质素合成途径中的关键酶。本文采用RACE和PCR方法,获得了GbC3H基因的全长cDNA序列及其基因组序列,两者之间序列比对结果表明,GbC3H基因含有三个外显子和两个内含子。蛋白多重比对结果表明,推导的GbC3H蛋白和其它植物来源的C3H蛋白具有很高的相似性。C3H系统发生树分析结果表明,GbC3H与裸子植物的C3H具有更近的进化关系。Southerm blot分析表明,GbC3H基因属于一个多基因家族。RT-PCR分析表明,GbC3H基因在根和叶中表达,在茎中检测不到表达。GbC3H已被构建到植物表达载体PBI121中并用于植物的遗传转化,并且已经得到PCR检测为阳性的烟草植株。WRKY蛋白是存在于植物中的一类转录调节因子超家族,具有广谱的调节基因转录的功能,并且可能参与了黄酮类化合物生物合成。本文采用RACE和PCR方法,获得了BcWRKY基因的全长cDNA序列及其基因组序列,两者之间的序列比对结果表明,BcWRKY基因含有五个外显子和四个内含子,具有典型的转录因子基因结构特征。通过基因组步移的方法获得了BcWRKY基因的5’侧翼序列,发现其中包含了WRKY蛋白的识别元件W-box,因此BcWRKY基因可能具有自我调节转录的功能。此外,包括TATA盒和胁迫应答元件在内的一些顺式作用元件也被预测和分析。蛋白序列多重比对结果表明,推导的BcWRKY蛋白的WRKY domain和其它植物来源的WRKY蛋白的WRKY domain具有很高的相似性。同源性建模产生的BcWRKY的WRKY domain与拟南芥AtWRKKY4的WRKY domain具有一样的三维结构。RT-PCR分析表明,BcWRKY基因在根、茎和叶中的表达水平不同,而且BcWRKY基因的表达受水杨酸、细菌侵染和伤害处理的诱导。原核表达的重组BcWRKY蛋白的分子量大小和通过生物信息学预测的分子量大小相同。Western blot分析表明,含有6×His标签的重组BcWRKY蛋白可以和6×His抗体产生特异的免疫反应。BcWRKY已被构建到植物表达载体pCAMBIA2300中并用于植物的遗传转化,并且已经得到PCR检测为阳性的烟草植株。同时,本实验室构建的p1304-GbCHS和p1304-GbFLS表达载体转化烟草并已经得到了PCR检测为阳性的单转、共转烟草植株。P35S-2300-BcWRKY表达载体分别与p1304-GbC4H、p1304-GbCHS和p1304-GbFLS表达载体转化烟草的PCR阳性植株也已经得到。银杏愈伤组织的转化正在进行中。本文对上述基因的研究为进一步阐明银杏黄酮类化合物生物合成的分子生物学、分子遗传学和生物化学机理打下了坚实的基础,同时也为利用代谢工程生产对人体健康有益的银杏黄酮创造了条件。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 黄酮类化合物生物合成的研究进展
• 1.1.1 黄酮类化合物的分布和分类
• 1.1.2 黄酮类化合物的作用
• 1.1.3 黄酮类化合物的性质
• 1.1.4 黄酮类化合物的生物合成
• 1.1.4.1 黄酮类化合物生物合成途径中的结构基因
• 1.1.4.2 转录因子及其在黄酮合成中的调控作用
• 1.2 与黄酮类化合物合成途径相关的生物合成途径
• 1.3 转录因子WRKY
• 1.4 本文的研究目的和意义
• 第二章 银杏肉桂酸-4-羟化酶基因的克隆和分析
• 2.1 材料与试剂
• 2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 第三章 银杏香豆酸-3-羟化酶基因的克隆和分析
• 3.1 材料与试剂
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 第四章 白菜WRKY编码基因的克隆和分析
• 4.1 材料与试剂
• 4.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 第五章 植物表达载体的构建和转化
• 5.1 植物表达载体的构建
• 5.2 根癌农杆菌EHA105介导的植物遗传转化
• 5.2.1 叶盘法转化烟草
• 5.2.2 银杏的转化
• 5.2.2.1 银杏愈伤组织的诱导
• 5.2.2.2 银杏幼苗及愈伤的转化
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 植物表达载体的构建及烟草的转化
• 5.3.2 植物表达载体转化银杏愈伤
• 5.3.2.1 银杏愈伤的诱导
• 5.3.2.2 银杏幼苗及愈伤的转化
• 总结
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间发表的SCI论文
• 致谢