胸腺素β4对膀胱癌上皮—间质转化调控作用的实验研究

论文摘要

第一部分胸腺素β4与人膀胱移行细胞癌上皮间质转化的关系目的：探讨人胸腺素β4与膀胱移行上皮癌（BTCC）上皮-间质转化的相关性,以及与临床病理特征之间的关系。方法：选用膀胱移行细胞癌手术切除标本60例,每例标本均选用癌组织中心、癌旁组织及其远端正常黏膜对照。采用定量RT-PCR、Western blot和免疫组织化学技术检测切除标本中的Tβ4、ILK、E-cadherin和β-catenin的表达,并分析与各临床病理因素之间的关系。结果：（1）Tβ4在BTCC组织中的表达明显高于正常黏膜（91.7% vs 15.0%,P<0.05）,其在深层浸润组中的表达高于浅层浸润组（97.4%vs 81%,P<0.05）；ILK在BTCC组织中的表达明显高于正常黏膜（80.0%vs18.3%,P<0.05）；β-catenin在BTCC组织中的表达高于正常黏膜（76.7% vs 26.7%,P<0.05）；E-cadherin在BTCC组织中的表达明显低于正常黏膜（30.0% vs 90.0%,P<0.05）；（2）Tβ4与E-cadherin表达呈负相关,与ILK、β-catenin表达呈正相关。结论：胸腺素β4与膀胱移行上皮癌分化和转移有关,可能通过调控上皮-间质转化从而在膀胱移行上皮癌的侵袭转移过程中发挥作用。第二部分基因沉默胸腺素β4对膀胱移行细胞癌上皮间质转化的逆转作用目的：探讨胸腺素β4基因沉默对膀胱癌细胞EMT的逆转,进一步研究其在肿瘤侵袭转移中的作用机制。方法：使用针对Tβ4的慢病毒载体（Lenti-Tβ4）转染膀胱癌细胞株T24。采用定量RT-PCR、Western blot法检测Tβ4、ILK和上皮性标记基因E-cadherin、β-catenin的表达改变；Immunofluorescence法检测ILK、E-cadherin、β-catenin在转染后T24细胞中的表达改变；细胞划痕实验、Boyden小室体外侵袭实验、AO/EB荧光染色法反映细胞转移潜能和凋亡的变化。结果：转染后的T24细胞,Tβ4、ILK和β-catenin基因或蛋白表达下调,而上皮标记基因E-cadherin表达增强（p<0.05）；Immunofluorescence显示ILK和β-catenin在细胞质、细胞核中表达减弱,而E-cadherin在胞膜中表达增强,细胞形态向正常上皮细胞转化；转染后的T24细胞体外迁移能力与侵袭力下降,细胞凋亡增多。结论：肿瘤细胞中的Tβ4表达下调可以逆转肿瘤细胞的间质表型,而向正常上皮表型转化,降低肿瘤转移潜能。第三部分Tβ4-siRNA慢病毒载体逆转膀胱癌细胞上皮间质转化的体内实验研究目的：构建可荧光示踪的膀胱癌小鼠皮下移植瘤模型及肺转移模型,并探讨活体内抑制Tβ4基因表达对膀胱癌生长侵袭、转移及血管形成的影响,为后续研究奠定基础。方法：（1）选用膀胱移行细胞癌细胞株EJ,体外扩增培养制成细胞悬液后注射于BALB/C小鼠颈背部皮下,待有肉眼可见瘤块后,处死小鼠并取出肿瘤组织。对肿瘤组织进行病理组织学观察,免疫组化方法检测Tβ4、ILK、E-cadherin和β-catenin在移植瘤中的表达,TUNEL方法检测活体内抑制Tβ4基因表达对膀胱癌细胞的促凋亡作用,体外血管形成实验检测Tβ4表达下调对血管生成的影响。（2）将膀胱移行细胞癌细胞株EJ悬液接种于BALB/C小鼠尾静脉内,于术后第20天处死小鼠,观察胸腔及肺内转移灶大小、数量,观察生存天数,记录远处转移情况。结果：（1）EJ细胞以慢病毒Lenti-Tβ4转染后形成的膀胱癌移植瘤与EJ细胞慢病毒Lenti-GFP转染（阴性对照）后形成的移植瘤比较,移植瘤体积、湿重、小鼠平均生存天数均存在差异,差异有统计学意义（P<0.05）；移植瘤组织HE染色发现,干扰移植瘤中Tβ4基因表达,癌组织恶性程度相较于未干扰组低；Lenti-Tβ4组中Tβ4、ILK和β-catenin阳性表达率明显低于阴性对照组,而E-cadherin阳性表达率明显高于阴性对照组；Lenti-Tβ4组凋亡率明显高于阴性对照组；与空白对照组、阴性对照组相比,Lenti-Tβ4转染组促进血管形成能力下降66.8%,有统计学意义（P<0.01）。（2）BALB/C新生仔鼠尾静脉注入膀胱癌细胞EJ后,20d后解剖取出肺组织,阴性对照组肺组织表面不光滑,肉眼见肺表面弥漫性斑块,最大直径1.5 cm,而Lenti-Tβ4转染组肺组织中转移灶明显变小或未见明显转移灶,各组小鼠的肝脏、脾脏、心脏、骨均未发现明显转移。结论：携带干扰序列Tβ4-siRNA的慢病毒能有效地抑制Tβ4基因的表达,从而抑制膀胱癌细胞体内的侵袭能力,同时发现Tβ4基因表达与膀胱癌细胞的转移活性及血管生成相关,下调其表达水平能够明显抑制癌细胞的转移能力。

论文目录

• 前言
• 参考文献
• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 胸腺素β4与人膀胱移行细胞癌上皮间质转化的关系
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第二部分 基因沉默胸腺素β4对膀胱移行细胞癌上皮间质转化的逆转作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第三部分 Tβ4-siRNA慢病毒载体逆转膀胱癌细胞上皮间质转化的体内实验研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 全文总结
• 综述
• 参考文献
• 附录一 攻读学位期间发表论文目录
• 附录二 英文缩略词表
• 致谢