论文摘要
研究背景：阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）是中枢神经系统最常见的变性疾病,其典型的临床表现为进行性加重的记忆力减退、认知功能障碍、行为异常和社交障碍。主要的病理改变为神经纤维缠结（neurofibrillarytangle,NFT）、老年斑形成（senileplaque, SP）和神经元缺失。AD的发病机制复杂,病因至今不清,自20世纪80年代以来形成了各种假说,目前普遍公认的是β淀粉样蛋白β-amyloid protein, Aβ)假说,Aβ是SP的主要组成成分,由β淀粉样蛋白前体蛋白（Aβ precursor protein, APP）通过β、γ分泌酶水解产生。AD的发生、发展与Aβ因代谢障碍而在基底前脑异常沉积密切相关。而且近年来的研究发现,与纤丝状Aβ相比较Aβ寡聚体具有更高的神经毒性,是AD发病过程中的主要毒性物质。只是目前Aβ寡聚体的整体动物行为学实验结果还存在争议,不同聚集形式Aβ之间整体动物水平上的对比研究也较少。目前关于AD发病过程的研究提示,Aβ激活胶质细胞诱发中枢神经系统慢性炎症损伤可能是导致AD的一个核心病理环节,参与该炎性反应的主要是小胶质细胞（microglia, Mi）,位于Mi表面的Toll样受体（Toll—like receptors, TLRs）及其辅助受体CD14共同参与了Aβ激活Mi的过程,但是上述结论多来自纤丝状Aβ的研究,TLRs能否识别寡聚体的Aβ还没有定论。此外,AD的基础研究过程中动物模型的建立一直是关键,但是目前各类模型都存不足,还没有任何一种动物模型能全面再现、模拟AD的病理、生化、行为学等方面的全部特征。本实验使用微渗泵将Aβ1-42聚合体和寡聚体持续灌注至大鼠侧脑室建立AD模型,从而使大量Aβ缓慢持续弥散性地分布到老龄大鼠脑内,较好地解决了同类模型Aβ短时在注射点局部聚集的问题,与AD的临床病理过程更接近。中药海风藤是胡椒属植物风藤的滕的茎，中国药典记载其具有通经络、祛风湿和止痹痛的功效,现代医学研究发现其具有抗炎和神经保护作用,近年来开始应用于AD的治疗研究。本研究应用纤丝状Aβ1-42和Aβ1-42寡聚体侧脑室持续灌注制备AD大鼠模型,观察两种不同聚集形式的Aβ对大鼠行为学、海马区神经细胞超微结构及Toll样受体4（Toll—like receptor4,TLR4）等炎症因子表达的影响,同时应用海风藤提取物干预治疗,观察其对上述指标的作用,以期进一步揭示AD的发病机制、探寻安全有效的治疗方法。目的：探讨纤丝状Aβ1-42与Aβ1-42寡聚体对大鼠行为学、海马区神经细胞超微结构及TLR4、核因子-KB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）、肿瘤坏死因子-α （tumor necrosisfactor-α,TNF-α）表达的影响；探讨应用海风藤干预后上述指标的变化。方法：健康雄性SD大鼠60只,随机数字表法平均分为10组：正常对照组（Control组）、假手术组（Sham组）、纤丝状Aβ+载体1组（FAβ组,脑室内灌注纤丝状Aβ+乙腈和三氟乙酸造模）、纤丝状Aβ+海风藤提取物（Piper kadsura ohwi PKO）组（FAβ+PKO组,脑室内灌注纤丝状Aβ+乙腈和三氟乙酸造模,腹腔注射PKO治疗）、纤丝状Aβ+二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide DMSO）组（FAβ+DMSO组,脑室内灌注纤丝状Aβ+乙腈和三氟乙酸,腹腔注射DMSO）.载体1组（Veh1组,脑室内不注射Aβ,仅灌注乙腈和三氟乙酸）、Aβ寡聚体+载体2组（AβO组，脑室内灌注Aβ寡聚体+高密度脂蛋白和羟乙基哌嗪乙磺酸造模）、Aβ寡聚体+PKO（A βO+PKO组,高密度脂蛋白和羟乙磺酸造模,腹腔注射PKO治疗）、Aβ寡聚体+DMSO组（AβO+DMSO（?）（?）,脑室内灌注Aβ寡聚体+高密度脂蛋白和羟乙基哌嗪乙磺酸,腹腔注射DMSO）、载体2组（Veh2组,脑室内不注射Aβ,仅灌注高密度脂蛋白和羟乙基哌嗪乙磺酸）。采用微渗泵向侧脑室持续灌注纤丝状Aβ1-42或Aβ1-42寡聚体法制作动物模型。造模后每天给FAβ+PKO组和AβO+PKO组大鼠腹腔注射浓度10%含2.5%DMSO的PKO,按体重给药（1ml/100g）,FAβ+DMSO组和AβO+DMSO组大鼠每天仅给予2.5%DMSO（?）腹腔注射（1ml/100g）,连续给药35天。造模后第31天开始进行Morris水迷宫实验评定大鼠的学习记忆功能，喧闹验分为空间探索和定向航行两部分。空间探索实验时记录大鼠的逃避潜伏期,定向航行实验时录制大鼠在水迷宫游动视频，计算其穿越平台次数,在平台所在象限穿行的时间比率和路程比率。电镜观察海马区神经细胞超微结构,实时荧光定量聚合酶链式扩增反应（real-timepolymerasechainreactio,RT-PCR）法检测海马区TLR4mRNA表达,免疫印迹法（Western blot,WB）检测NF-κBP65、TLR4蛋白表达,酶标记免疫吸附法（ELISA）检测INF-α的表达。结果：（1）水迷宫实验结果：Control组、Sham组、Veh1组和Veh2组之间比较逃避潜伏期、穿越平台的次数、时间比率和路程比率无显著性差异（P均>0.05）；FAβ组与FAβ+DMSO组比较、AβO组与AβO+DMSO组比较逃避潜伏期、穿越平台的次数、时间比率和路程比率无显著性差异（P均>0.05）；FAβ组、FA β+DMSO组和AβO组、A β O+DMSO组与Control组、Sham组、Veh1组和Veh2组比较逃避潜伏期显著延长、穿越平台的次数显著减少、时间比率和路程比率也显著减低（P均<0.05）；AβO组与FAβ组比较逃避潜伏期显著延长、穿越平台的次数显著减少、时间比率和路程比率也显著减低（P均<0.05）；FA β+PKO组和A β O+PKO组与Control组、Sham组、Veh1组和Veh2组比较逃避潜伏期显著延长、穿越平台的次数显著减少、时间比率和路程比率也显著减低（P均<0.05）；但与FAβ组、FAβ+DMSO组和AβO组、A β O+DMSO组比较逃避潜伏期显著缩短、穿越平台的次数显著增加、时间比率和路程比率也显著增高（P均<0.05）。（2）电镜下海马CA1区神经细胞超微结构观察：Control组、Sham组、Veh1组和Veh2组海马CA1区神经细胞超微结构未见明显异常；AβO组和A β O+DMSO组与FAβ组和FAβ+DMSO组均见到神经细胞大量凋亡和不同程度的损伤,以AβO组损伤最严重；FAβ+PKO组和AβO+PKO组均可见少量凋亡神经细胞,神经细胞损伤程度AβO组和AβO+DMSO组与FAβ组和FAβ+DMSO组较轻。（3）电镜半薄切片光镜下海纪CA1区凋亡神经细胞观察：Control组、Sham组、Veh1组Veh2组大鼠海马CA1均可见极少量凋亡神经元,但凋亡神经元数量间比较无显著性差异（P>0.05）； FAβ组、FAβ+DMSO组、AβO组和AβO+DMSO组大鼠海马CA1区均见大量凋亡神经元,且凋亡神经元数量较Control组、Sham组、Veh1和Veh2组显著增多（P均<0.05）,但FAβ组与FAβ+DMSO组比较、AβO组与A β O+DMSO组比较凋亡神经元数量无显著性差异（P均>0.05）；AβO组大鼠海马CA1区凋亡神经元数量较FAβ组明显增多（P<0.05）:FAβ+PKO组和AβO+PKO组凋亡神经元数量较Control组、Sham组、Veh1组、Veh2组增多（P均<0.05）,但与FAβ组、FA β+DMSO组、AβO组和A β0+DMSO组比较明显减少（P均<0.05）。（4）RT-PCR、WB、ELISA结果：Comtrol组、Sham组、Veh1组和Veh2组之间比较TLR4、NF-κB、TNF-α表达无显著性差异（P均>0.05）；FAβ组与FAβ+DMSO组比较、AβO组与AβO+DMSO组比较TLR4、NF-κB、TNF-α表达无显著性差异（P均>0.05）；FAβ组、FAβ+DMSO组、AβO组和AβO+DMSO组与Control组、Sham组、Veh1组和Veh2组相比TLR4、 NF-κB、TNF-α表达均显著增强（P均<0.05）；AβO组TLR4、NF-κB、TNF-α表达较FAβ组增强（P<0.05）；FAβ+PKO组和AβO+PKO组TLR4、NF-κB、TNF-α表达较Control组、Sham组、Veh1组、Veh2组增多（P均<0.05）,但与FAβ组、FAβ+DMSO组、AβO组和A β O+DMSO组比较TLR4、NF-κB、TNF-α表达明显减少（P均<P.05）。（5）偏相关分析结果：TLR4、NF-κB、TNF-α与穿越平台次数都呈现负相关（P均=0.000）,TLR4、 NF-κB、TNF-α之间均为正相关（P均=0.000）。结论：（1）向一侧侧脑室持续灌注八Aβ1-42能成功建立AD动物模型；（2）纤丝状Aβ1-42和Aβ1-42寡聚体均可诱导神经细胞凋亡、损伤和TLR4、 NF-κB、TNF-α表达增高,导致大鼠学习记忆功能障碍。（3）Aβ1-42寡聚体可被TLR4识别,而且与纤丝状Aβ1-42相比较,其诱导的TLR4、NF-κB、TNF-α表达理高,细胞凋亡、损伤和大鼠学习记忆功能障碍更严重。（4）海风藤干预能部分改善Aβ诱导的大鼠学习记忆功能障碍，其机制可能与减少炎症因子TLR4、NF-κB、TNF-α表达、抑制神经细胞亡有关。
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