论文摘要
东亚钳蝎（Buthus martensii Karsch,BmK）镇痛抗肿瘤活性肽（Analgesic-antitumorpeptide,AGAP）是一种具有镇痛抗肿瘤活性的蝎毒素。其基因序列长302bp,该序列编码85个氨基酸,其中N末端19个氨基酸为信号肽,成熟肽由66个氨基酸组成。人们对蝎毒素的研究已经进行了几十年,但是关于蝎毒素结构与功能之间相互关系的研究还只是刚刚起步。本实验主要是通过对BmK-AGAP一级结构的改变,从而初步研究其结构与功能关系。首先,通过DNA重组技术将His-AGAP-K-K的编码基因克隆至表达载体pET-28a（+）中,并将构建好的表达载体pET-28a-His-AGAP-K-K转入大肠杆菌BL21（DE3）进行IPTG诱导表达,表达产物His-AGAP-K-K的表达量可以达到32%,主要以包涵体的形式存在。通过设计不同的下游引物,进行PCR扩增获得不同的AGAP基因。原有的BmK-AGAP编码的蛋白C末端为2个Gly,而经改造后的基因,分别在BmK-AGAP后增加编码2个LVs、1个Glu和2个Glu;另外,原有BmK-AGAP编码的BmK-AGAP第62位为LVs,而经基因改造后,分别编码Gly和Glu。将这五个目的基因克隆至表达载体pSYPU-1b中,构建了五个重组质粒pSYPU-1b-His-AGAP-K-K、pSYPU-1b-His-AGAP-E、pSYPU-1b-His-AGAP-E-E、pSYPU-1b-His-AGAP-62-Gly和pSYPU-1b-His-AGAP-62-Glu,转入大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,五种目的蛋白均得到了可溶性的表达。通过金属螯合层析的方法,从表达产物中分离纯化出了重组蛋白His-AGAP-K-K、His-AGAP-E、His-AGAP-E-E、His-AGAP-62-Gly、His-AGAP-62-Glu。采用小鼠醋酸扭体法测定镇痛活性,小鼠给药在相同剂量（0.1364μmol/kg）下,其对小鼠扭体反应抑制率分别为51.23%、29.54%、28.76%、22.59%、14.04%。实验通过对BmK-AGAP的五种突变体的活性进行研究,进一步探索了AGAP的结构与功能关系。
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标签：东亚钳蝎论文; 镇痛抗肿瘤活性肽论文; 突变体论文; 结构与功能论文;