抗铅联合苯酚降解多功能菌的构建

论文摘要

本文对高效降酚菌和抗铅菌做质粒消除实验,并提取相关质粒转化到大肠杆菌DH5α中,初步定位相关功能基因的位置。通过质粒转移方法构建抗重金属铅联合苯酚降解的环境多功能菌。测试转化子在含铅环境下的降酚效果,同时提取抗铅降酚转化子中的质粒电泳进行分子验证。研究了不同环境条件对转化子的生长状况的影响,及不同环境条件下转化子对苯酚的降解效果及质粒遗传稳定性。取得研究结果如下:1.通过质粒消除实验,高效降酚菌株降酚能力显著降低,抗铅菌株仍然保持原有抗铅性状。提取高效降酚菌株中质粒转化到大肠杆菌DH5α中,转化后大肠杆菌DH5α获得了降酚性能。2.提取高效降酚菌质粒,转化到抗铅菌感受态细胞,筛选出有效的转化菌株,测试抗铅降酚转化子在含高浓度铅时的降酚能力,转化子在100mg/L铅浓度下,对500mg/L苯酚降解率在第89h达到97.4%,确认用质粒转移方法能够成功构建既能抗重金属铅又能有效降解苯酚的多功能菌。3.通过接入一定量的抗铅降酚转化子富集液到以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基中,隔一定时间测其苯酚降解率,观察不同条件下抗铅降酚转化子的降解活性。在铅浓度50～300mg/L,转化子都能快速有效降解底物中的苯酚。不同苯酚初始浓度下,苯酚被转化子完全降解所需时间差异较大,随着酚浓度增大,其所需时间越长,完全降解所需时间差异主要表现在延滞期所需时间不同。温度对转化子降解苯酚影响表现为,在20～25℃,随着温度升高,完全降解所需降解时间越短,25～30℃随着温度升高降解时间越长,当温度升至35℃时,转化子无法有效降解培养液中的苯酚。在pH值5～7时,转化子完全降解苯酚所需时间相差不大,但是当pH值升高后,苯酚降解受抑制。向培养基添加葡萄糖时,发现低浓度的葡萄糖能促进转化子对苯酚的降解,高浓度抑制其对苯酚降解。4.通过测试抗铅降酚转化子在OD600的吸光度值观察抗铅降酚菌在不同环境中的生长量,转化子在pH值5～9,温度25～40℃范围内生长良好;对苯酚耐受能力较强,能在500mg/L苯酚浓度仍然保持较高的生长量;当转速达到100r/min后生长旺盛。5.在不同环境条件下富集培养后的抗铅降酚转化子分别稀释涂布到含酚选择板和无酚非选择板上培养后,计算选择板与非选择板上菌落数的比值,来衡量环境条件对抗铅降酚转化子质粒遗传表达稳定性的影响。温度对其稳定性影响较大,达到40℃高温转化子质粒容易丢失。酚胁迫下,在苯酚浓度从50～500mg/L范围内,随着苯酚浓度升高,转化子稳定性逐渐提高。适当的振荡培养转速下转化子的稳定性较高,过低或过高的转速都会降低转化子中质粒的稳定性。pH值在5～9范围时对质粒稳定性的影响相对较小,影响不大。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 一 引言
• 1.1 生物强化技术
• 1.1.1 高效菌株培育
• 1.1.2 高效菌株构建
• 1.2 质粒转化构建多功能菌
• 1.2.1 质粒分离
• 1.2.2 感受态制备与质粒转化
• 1.2.3 转化子筛选与重组子的鉴定
• 1.3 质粒稳定性
• 1.3.1 质粒不稳定性类型及原因
• 1.3.2 遗传因素对质粒稳定性的影响
• 1.3.3 培养条件对质粒稳定性的影响
• 1.4 论文研究意义及内容
• 二 材料及方法
• 2.1 主要实验仪器
• 2.2 实验药品及培养基
• 2.3 菌种来源
• 2.4 苯酚含量测试[88]
• 2.4.1 试剂配制
• 2.4.2 实验步骤
• 2.4.3 苯酚浓度计算
• 2.4.4 酚去除率计算
• 2.5 质粒提取及电泳
• 2.5.1 试剂配制
• 2.5.2 实验步骤
• 2.6 感受态细胞制备及质粒转化[89]
• 2.7 质粒消除
• 2.8 抗铅降酚转化子的筛选
• 2.9 抗铅降酚转化子的环境适应性研究
• 2.9.1 不同条件对抗铅降酚转化子生长量的影响
• 2.9.2 不同条件对抗铅降酚转化子稳定性影响
• 2.9.3 不同条件下抗铅降酚转化子的降解特性
• 三 结果及分析
• 3.1 苯酚降解菌及抗铅菌的相关功能基因初步定位
• 3.1.1 苯酚降解菌株及抗铅菌株特性
• 3.1.2 降酚菌及抗铅菌的相关功能基因初步定位
• 3.2 抗铅联合苯酚降解多功能菌的构建
• 3.2.1 抗铅降酚菌的构建
• 3.2.2 抗铅降酚转化子抗铅降酚效果
• 3.2.3 抗铅联合苯酚降解菌株的分子验证
• 3.3 抗铅降酚转化子环境适应性研究
• 3.3.1 不同条件下抗铅降酚转化菌酚降解效果
• 3.3.2 不同条件对抗铅降酚转化子生长量影响
• 3.3.3 抗铅降酚转化菌稳定性实验
• 四 讨论
• 五 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间发表论文