扰动剪切流场对内皮细胞小窝蛋白再分布和表达量及NO合成的影响

论文摘要

目前,大量的研究表明动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）病变有很大的几率是发生在扰动剪切力存在的区域,比如血管分支处。小窝蛋白-1（Caveolin-1,Cav-1）是小窝的重要组成部分,也是小窝的标志性蛋白,Cav-1能与多种关键性信号分子如胰岛素受体、eNOS等连接,对其活性状态起直接调控作用,从而参与了细胞分化与增殖、炎症、心肌肥厚、衰老等多种病理、生理过程。有关小窝及Cav-1在剪切力诱导的信号传导中担当重要角色的报道已有不少,但AS好发部位复杂流型对CAV-1分布与表达有什么影响至今没有报道,所以目前的研究结果还不足以解释Cav-1在动脉粥样硬化病变中的重要作用。因此,本研究中利用一种带后向台阶的流动腔,模拟AS好发部位血液的特殊流动状态,探索在扰动流作用下细胞Cav-1分布特点和表达量的变化。eNOS的活性催化部位主要位于小窝膜上,并存在与CAV-1脚手架区相连接的序列,其产物NO是血管内环境稳定的重要调节因子,尤其与动脉粥样硬化的发生关系密切,所以检测扰动流作用下NO合成情况,间接的探讨Cav-1与eNOS活性的关系,为揭示扰动流在AS发病机制中的作用提供一些探讨工作。方法将细胞接种到流动腔,取加载作用6h、12h、24h和48h后的细胞与静止态的细胞进行活细胞染色,利用激光共聚焦显微镜扫描,分析内皮小窝蛋白的分布情况,并在相同时间点取加载作用的细胞与静止态的细胞进行Real Time PCR,检测内皮小窝蛋白相对表达量的变化,收集每个时间点的细胞培养基,利用NO试剂盒检测NO的合成情况结果扰动剪切作用下,小窝蛋白发生明显的再分布,向细胞边缘聚集,并没有出现单边极化的现象;内皮细胞Cav-1相对表达量随着加载时间的延长逐渐减少,在扰动剪切力作用下48 h后内皮细胞Cav-1相对表达量减少了40%;NO的合成量随着加载时间的延长持续降低的走势,加载48 h后NO的合成量大幅的低于静止态ECs合成NO的量,减少了近30%。结论扰动流场作用下内皮细胞小窝蛋白在单细胞边缘的分布和相对表达量的降低,可能进一步通过力-化学信号的耦合形式,最终会对细胞的生物学行为产生影响;从长时间来看NO的合成量会随着加载时间的延长继续降低,Cav-1对eNOS活性的抑制在其中发挥了重要作用,NO的合成量的降低可能导致白细胞与内皮细胞黏附几率增加,血小板附着加强,血管平滑肌细胞增殖提高,从而引起动脉粥样硬化病变。本文通过研究扰动剪切流场下Cav-1表达和分布以及NO合成,为AS多发于扰动流场下的机制提供了新的参考。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 小窝与小窝蛋白的发现及其结构的认识
• 1.1.2 小窝与小窝蛋白的生物学功能
• 1.1.3 小窝蛋白-1 在肿瘤中的研究
• 1.1.4 小窝蛋白-1 在心血管系统中的作用
• 1.1.5 小窝蛋白-1 在流体力学刺激下的信号响应
• 1.2 立题依据
• 1.3 研究内容
• 2 流动腔的构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要材料
• 2.2.2 PDMS 流动腔的制作
• 2.2.3 流场的数值分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 流动腔的加工
• 2.3.2 流动腔
• 2.3.3 数值模拟
• 2.4 讨论
• 3 扰动流场剪切作用对 Cav-1 再分布影响的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要的试剂与仪器
• 3.2.2 细胞培养和种植
• 3.2.3 内皮细胞的扰动加载实验
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 流动系统的校正
• 3.3.2 内皮细胞Cav-1 的分布情况
• 3.4 讨论
• 4 扰动剪切流场作用下 Cav-1 表达量变化的研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 细胞培养与种植
• 4.2.4 内皮细胞Cav-1 的荧光定量PCR 检测
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 内皮细胞Cav-1 mRNA 的表达
• 4.4 讨论
• 5 扰动剪切流场对内皮细胞合成NO 水平的影响
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 主要材料
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 细胞培养与种植
• 5.2.4 内皮细胞的扰动剪切加载实验
• 5.2.5 灌流液中NO 的检测
• 5.3 结果
• 5.4 讨论
• 6 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 本研究的创新点
• 6.3 存在的不足和后续工作的建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录