猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用

论文摘要

猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV-2）是当前影响养猪业发展的3种重要的病原。由于PPV、PRV、PCV-2单独感染或混合感染均能引起猪发病,造成母猪的繁殖障碍或（和）感染猪的免疫抑制,为其他病原的继发感染提供了便利,甚至会造成猪群中疫病的流行,使养殖效益蒙受损失。聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）具有快速、敏感、特异等优点,自发明以来在病原的特异性检测方面表现出明显的优势,在动物疫病诊断和病原检测上也得到广泛地应用,对疫病防控起到了重要的作用。由于当前养猪业中猪群中多种病原混合感染病例的增多,单一病原PCR检测方法也表现出自身的不足,需要对一种病料进行多次PCR检测,使得检测时间延长,耗费人力,成本也高。多重PCR不仅保持了普通PCR敏感性高和特异性强的优点,而且还具有一个PCR反应就同时检测多种病原,具有简便、快捷、灵敏等优点,能满足生产上同时对多种疾病进行快速诊断的要求。本研究基于前期对陕西省部分养殖企业猪群中病毒性病原的调查检测,发现常有PPV、PRV和PCV-2的单纯或混合感染,为此我们拟建立PPV、PRV和PCV-2检测的多重PCR方法,以期为生产中这3种病原的快速检测提供可用方法。本研究获得了以下结果:（1）根据GenBank中已经发表的PPV、PRV和PCV-2的全基因序列,利用DNAStar和Oligo6.0软件,针对病毒的保守性基因序列,分别设计了检测引物,通过对引物浓度、退火温度、PCR组分等条件的优化建立起鉴别PPV、PRV和PCV-2多重PCR方法,方法敏感性试验表明,PRV、PCV-2在多重PCR反应中的敏感性到达pg级,而PRV在多重PCR反应中的敏感性少了一个数量级,其最低检测量也达到了10pg级。以PCV-1、牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、大肠埃希菌、PPV、PRV、PCV-2为模板分别进行多重PCR检测,结果表明只有PPV、PRV和PCV-2多重PCR及单个病毒的PCR均扩增出各自的特异性条带。（2）用建立的方法对采自陕西省部分猪场的286份病料及血样进行病毒检测,从临床健康猪全血样品中PPV、PRV和PCV-2的检测结果来看,PCV-2在正常猪群中有一定比例的存在,同时在个别猪场也存在PRV和PCV-2双重感染的现象;从临床患病猪病料中进行检测发现,PRV和PCV-2混合感染较严重,并有PPV+PRV+PCV-2三重感染发生;多重PCR检测结果与单项PCR检测结果的符合率达99%以上,说明建立的多重PCR检测方法可用于临床样品的检测,为这3种疫病的诊断提供依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型检测方法研究进展
• 1.1 猪细小病毒
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 猪细小病毒的特性
• 1.1.3 猪细小病毒病流行情况
• 1.1.4 PPV 的检测方法研究
• 1.2 伪狂犬病病毒
• 1.2.1 概述
• 1.2.2 伪狂犬病病毒的特性
• 1.2.3 伪狂犬病流行情况
• 1.2.4 伪狂犬病病毒检测方法
• 1.3 猪圆环病毒
• 1.3.1 概述
• 1.3.2 猪圆环病毒的特性
• 1.3.3 猪圆环病毒检测方法
• 第二章 聚合酶链反应（PCR）技术在动物病原检测上的应用
• 2.1 PCR 技术概述
• 2.1.1 PCR 技术
• 2.1.2 PCR 技术的发展
• 2.2 主要的PCR 技术
• 2.2.1 常规PCR
• 2.2.2 套式PCR（nested PCR）
• 2.2.3 二温式PCR
• 2.2.4 反转录PCR （RT PCR）
• 2.2.5 反转录一复合套式聚合酶链反应
• 2.2.6 反向PCR
• 2.2.7 竞争PCR （compete PCR）
• 2.2.8 标记PCR （LP-PCR）
• 2.2.9 定量PCR
• 2.2.10 玻片PCR (Slide-PCR
• 2.2.11 多重PCR（Multiplex PCR）
• 试验研究
• 第三章 猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2 型 PCR 检测方法的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 毒株、菌株和细胞
• 3.1.3 引物设计
• 3.1.4 病毒DNA 的提取
• 3.1.5 PCR 反应
• 3.1.6 PCR 反应条件的优化
• 3.1.7 PCR 产物的测序分析
• 3.1.8 PCR 反应的敏感性和特异性分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 最佳PCR 退火温度的确定
• 3.2.2 PCR 反应最佳引物体浓度的确定
• 3.2.3 PCR 产物的鉴定
• 3.2.4 PCR 反应的敏感性
• 3.2.5 PCR 反应的特异性试验和重复性试验
• 3.3 讨论
• 第四章 PPV , PRV和PCV 2多重PCR检测方法的建立与临床样品检测分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 毒株、菌株、细胞
• 4.1.3 临床样品及病料的采集
• 4.1.4 多重PCR 反应条件的优化
• 4.1.5 样品检测
• 4.2 结果
• 4.2.1 两重PCR 反应条件的优化
• 4.2.2 多重PCR 的建立
• 4.2.3 样品检测
• 4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介