论文摘要
第一章：Periostin基因在人结肠癌中的表达及临床意义目的：结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤。早发现、早诊断、早治疗是提高结肠癌患者生存率的关键所在。目前有很多非侵入性结肠癌筛查方法,血清癌胚抗原（CEA）筛查是最常见的方法之一。然而,CEA诊断结肠癌的敏感性和特异性较低。Periostin是最近发现的一种细胞基质蛋白,在多种组织尤其是在恶性肿瘤组织内过表达。本部分的研究目的为确定Periostin在结肠癌中的表达及临床意义。方法：健康对照组：随机挑选来我院体格检查正常者共12例,其中男性6例,女性6例,年龄48-75岁。结肠癌病人组：随机挑选2011年4月-2012年4月住院的20例结肠癌患者,年龄38-81岁,平均年龄为62岁,男性13例,女性7例。所有病例均经病理检查确诊,术前CEA检测资料齐备,并且未接收任何术前放化疗。其中淋巴结转移11例（55%）、肝转移6例、肺转移1例,组织学分化程度有高分化、中分化、低分化各5、7、8例。临床病理TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ期分别为5、4、4和7例。正常癌旁组织为取自同一手术切除标本且距肿瘤边缘约5-8cm。分别应用半定量RT-PCR和Western blot法检测结肠癌组织和正常组织中Periostin基因mRNA和蛋白表达水平。应用ELISA法检测结肠癌患者和正常对照血清Periostin浓度,并分析血清Periostin浓度与结肠癌临床病理参数的相关性。结果：RT-PCR检测结果显示：结肠癌组织中Periostin mRNA丰度明显高于癌旁正常组织。经过灰度分析发现,结肠癌组织中Periostin/GAPDH的值为1.35±0.61,而在癌旁正常组织中Periostin/GAPDH的值为0.33±0.21。两者之间的差异具有统计学意义（P<0.05）。Western blot法检测结果表明：Periostin蛋白质的表达量在结肠癌中显著高于癌旁正常结肠组织（P<0.05）。ELISA实验结果显示,在结肠癌病人血清中Periostin蛋白含量显著高于对照组正常人血清中Periostin的含量,分别为55.04±11.50ng/mL和23.31±6.72ng/mL,两者差异具有统计意义（P<0.05）。血清Periostin浓度与结肠癌病人淋巴结转移、远端转移以及TNM分期显著相关,浓度越高,肿瘤恶性度越高。然而,其血清浓度与病人年龄、性别、肿瘤大小和血清CEA水平无明显相关性。结论：Periostin基因在结肠癌组织中表达上调。结肠癌病人血清Periostin浓度显著高于健康正常人。血清Periostin浓度与结肠癌淋巴结转移、远端转移和高级别肿瘤分期显著相关。第二章：Periostin基因在结肠癌转移中的作用及机制目的：远端转移是恶性肿瘤患者死亡的重要原因。上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）是肿瘤细胞获得侵袭能力的一个关键事件。本部分研究目的为检测Periostin对细胞增殖、集落形成、粘附、侵袭、EMT等生物学行为的影响。方法：应用RT-PCR技术从结肠癌组织中扩增全长人Periostin cDNA,并将其克隆至pcDNA3.1（+）表达载体,构建人Periostin基因真核表达质粒。将pcDNA3.1-Periostin重组质粒或空载体分别转染人结肠癌细胞HT-29和SW480,应用G418筛选,建立Periostin稳定转染细胞系。应用MTT法测定细胞增殖改变；应用软琼脂集落形成实验测定细胞形成集落的能力；应用细胞黏附实验测定细胞黏附能力的改变；应用体外侵袭实验测定细胞侵袭能力的改变。倒置相差显微镜观察转染空载体或Periostin表达质粒SW480细胞形态变化,并应用Western blot法检测上皮细胞标志物E-cadherin和间质细胞标志物Vimentin的表达水平变化。结果：与未转染和转染空载体质粒的结肠癌细胞相比,转染pcDNA3.1-Periostin重组质粒结肠癌细胞Periostin水平显著增加,提高大约8-10倍。转染Periostin重组质粒、转染空载体质粒及未转染对照细胞增殖速度类似,差异均无统计学意义（P>0.05）。pcDNA3.1-Periostin转染SW480和HT-29细胞集落形成率分别为78±7%和67±13%,而转染空载体对照SW480和HT-29细胞集落形成率分别为80±14%和644±11%,经比较差异均无统计学意义（P>0.05）。应用体外细胞与基质粘附实验,通过酶标仪在570nm测定吸光度值,观察对照组细胞与实验组细胞对Ⅰ型胶原蛋白粘附能力的变化。结果发现实验组的OD值均显著高于对照组OD值,差异有统计学意义（P<0.05）：SW480对照和实验组OD值分别为0.43±±0.09和0.77±0.08；HT-29对照和实验组OD值分别为0.59±0.09和0.94±0.09。Transwell侵袭实验检测结果显示,转染空载体的SW480细胞（对照组）培养24h后穿膜细胞数为51±7个／视野；Periostin表达质粒转染组培养24h后穿膜细胞数达到98±±9个／视野,明显高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。倒置相差显微镜观察结果显示对照组SW480细胞仍保持上皮细胞形态,而转染Periostin重组质粒细胞则变为长梭状,为典型的间质细胞形态。Periostin转染细胞E-cadherin表达量下降而Vimentin蛋白表达量明显增加。结论：Periostin基因在结肠癌中具有促进肿瘤细胞粘附和侵袭的能力以及诱导结肠癌细胞发生EMT的能力。但Periostin基因对结肠癌细胞增殖和成瘤能力影响不显著。第三章：Periostin基因在结肠癌耐药性中的作用及机制目的：目前广泛用于结肠癌化疗的药物主要有三种,即氟尿嘧啶（Fluoropyrimidines）、奥沙利铂（Oxaliplatin）和伊立替康（Irinotecan）。它们可以单独使用也可以联用。本部分研究目的为揭示Periostin基因在结肠癌耐药性中的功能并探讨相关分子机制。方法：Oxaliplatin或5-FU处理SW480和HT-29细胞0-48h后,应用Western blot和RT-PCR法分别检测Periostin蛋白和：mRNA表达水平。SW480和HT-29细胞转染Periostin siRNA或对照siRNA,24小时后加入Oxaliplatin或5-FU处理48小时后,应用Annexin-v染色法测定细胞凋亡,并应用Western blot法测定切割型caspase-3和PARP以及Survivin蛋白表达水平。应用PCR法扩增全长人survivin基因,并将其克隆至真核表达载体,构建Survivin重组质粒。survivin基因与Periostin siRNA共转染SW480和HT-29细胞,孵育24小时后,应用Oxaliplatin或5-FU处理48小时,应用Annexin-v染色法测定细胞凋亡的变化。SW480和HT-29细胞转染Periostin表达质粒24小时后,应用Western blot法检测Survivin、总Akt和磷酸化Akt蛋白水平。应用P13K特异抑制剂LY294002（20μM）预处理SW480和HT-29细胞1小时,然后再转染Periostin表达质粒,应用Western blot法测定Survivin蛋白表达水平的变化。结果：Oxaliplatin和5-FU处理SW480和HT-29结肠癌细胞24h和48h后可明显诱导Periostin蛋白和mRNA水平增加。转染Periostin siRNA可显著抑制药物诱导的Periostin表达上调。Annexin V—FITC和PI双染法显示,与转染对照siRNA组相比,siRNA法引起的Periostin基因表达下调可显著增强Oxaliplatin和5-FU诱导的SW480细胞凋亡,凋亡细胞比例分别从10%和7%升至18%和20%。在HT-29细胞中可观察到类似的现象,Oxaliplatin和5-FU诱导的凋亡细胞百分比分别从对照组的6%和9%升至实验组的15%和22%o Western blot结果显示,在化学药物刺激条件下,转染Periostin siRNA的SW480和HT-29细胞中切割caspase-3和PARP蛋白水平较对照细胞显著增加,而Survivin蛋白水平较对照组细胞明显降低。过表达Survivin基因显著抑制Oxaliplatin或5-FU诱导的Periostin基因沉默结肠癌细胞凋亡,与未转染Survivin表达质粒组相比,凋亡率下降了约50%。Western blot法检测结果显示,Periostin过表达可导致SW480和HT-29细胞中Akt磷酸化水平明显增加,而对总Akt蛋白水平没有影响,这提示PI3K/Akt通路的活化。并且,应用PI3K特异抑制剂LY294002预处理可逆转Periostin过表达诱导的Survivin表达增加。结论：化疗药物处理可诱导结肠癌细胞periostin基因表达上调。该基因上调可通过激活Akt/survivin通路降低结肠癌细胞凋亡,增强化学耐药性。