1.河南广电计量检测有限公司河南郑州450000；2.河南广电计量检测有限公司河南郑州450000
摘要：提高农村户用沼气的产气量和农牧业废弃物的利用率，同时解决冬季户用沼气的产气量低的问题。试验以低温分离驯化的产甲烷菌为接种菌种，用猪粪、牛粪、羊粪及秸秆作为发酵原料，研究在低温8℃条件下，各种物料配比及pH、底物浓度、盐度对产甲烷菌的产气量的影响。结果表明，在8℃条件下，猪粪：牛粪：羊粪：秸秆=2：1：2：1的配比组的产气量高于其他试验组，用正交试验法测得的最佳发酵条件是pH为7.2，底物浓度为8%，盐度为4%。
关键词：产甲烷菌；低温；分离；驯化；沼气
农村沼气已成为我国发展生态农业的一个重要环节，有着广阔的发展前景，对改善民生条件有重要的战略意义。但是，在沼气池的实际运行中也存在一些普遍性的问题，突出表现在：寒冷低温季节沼气产量明显减少，同样数量的沼气原料产气量常常不及夏季的1/3；沼气发酵原料在池内得不到充分的分解和利用，实际沼气转换率（原料产气率）较低，发酵原料的产沼气潜力得不到充分发挥而被浪费[1]。
基于沼气的发酵，国内外在这方面做了大量研究。刘德江研究表明，与羊粪、猪粪相比，牛粪能提高发酵气体中的CH4含量[2]。张瑞红在用稻草发酵产沼气中，采用研磨和切碎两种物理预处理方法处理稻草[3]。发现研磨比切碎的预处理方法可提高产气量12.5%。罗清明等用NaOH化学处理玉米秸秆，秸秆细胞壁结构和化学成分发生了明显变化，提高沼气产量[4]。一般农作物秸秆的碳氮比为70︰1，畜禽粪便为15︰1，微生物产生沼气的最佳碳氮比为25︰1。吕淑霞等研究表明，发酵物中添加固体纤维素酶，甲烷产率可提高52.1%，添加液体纤维素酶，提高幅度可高达88.8%[5]。然而综合研究粪秆配比、温度及外源物质对沼气产量的研究较少。本试验研究在低温下，猪粪、牛粪、羊粪和秸秆的不同配比对沼气产量的影响，并探索pH、TS（总固体）浓度、盐度、尿素对沼气产量的作用，旨在为提高沼气产量提供理论依据。
1.1试验材料
1.1.1试验样品采集
沼液样品：从贵德沼气发酵池中采样而得。
发酵原料：猪粪、牛粪、羊粪、秸秆，从大通县采集而来。
1.1.2实验试剂
刃天青、Na2S、NaHCO3、MgCl2、KH2PO4、K2HPO4、NH4Cl、半胱氨酸、酵母膏、乙酸钠、甲酸钠、甲醇溶液、胰蛋白胨、NaCl、尿素
1.1.3试验仪器
BX51荧光显微镜（泽仕光电科技上海有限公司）
YQX-III厌氧培养箱（上海跃进医疗器戒厂）
TraceGCUltra气相色谱仪（北京绿绵科技有限公司）
SHP—1500型低温生化培养箱（上海金鹏分析仪器有限公司）
1.3试验方法
1.3.1产甲烷菌的分离筛选
样品采集后带回实验室立即接种至产甲烷细菌液体培养基中，将长3cm的小玻管装满接种液（0.6mL）倒放入培养基中收集气体，25℃静置培养1~2周后，再将培养物以4%接种浓度接种至新鲜培养基。如此重复，直到CH4含量越来越稳定为止。再在每5mL培养液中加入1.6万个单位无氧青霉素液进行抗生素筛选，将一些对抗生素敏感的杂菌除掉。此过程重复5次富集产甲烷细菌。将培养液压片在荧光显微镜下观察是否有发荧光的菌体，并分析倒置小玻管中气体的甲烷含量。
1.3.2产甲烷菌的低温分离驯化
将液体培养基在YQX—III厌氧箱内以每4.5mL分装于15×150规格的试管中，共分装12支试管，使用前将其进行还原，用1mL医用注射器吸取0.5mL分离后菌液接种至液体培养基，最后试管中的培养基体积为5mL。将试管分为两组：一组在25℃恒温培养箱中培养作试验对比组；一组至于8℃恒温培养箱中培养。一周后压片观察荧光现象，在荧光显微镜下，用100倍镜选一较好视野，对发光菌体进行观察。如8℃条件下有荧光现象，说明有耐低温的产甲烷菌存在。再提取菌液，用固体培养基做滚管操作，置于8℃中培养，用荧光显微镜观察，选取显荧光菌种做富集培养，如此重复，直到得到较纯化的耐低温产甲烷菌。
1.3.3不同物料配比试验
试验前将猪粪、牛粪、羊粪做风干处理，待其水分风干后，用研钵研成粉末，秸秆用剪刀剪成0.5cm的小段，根据不同底物的配料比例，配制试验底物，转入100ml医用小瓶，培养液总体积为50ml。在厌氧培养箱中，接种菌液2%。每组设置两个平行样，8℃低温培养一周，用气向色谱法测定产气量。
2结果与分析
2.1样品微生物分离筛选
试管培养基在培养过程中，培养液的颜色在第一天由红色变为无色，随着时间的增长，培养液中的气泡数量逐渐增多；培养1周左右，液体表面开始出现白色薄膜，同时培养液逐渐变浑浊，这是产产甲烷菌群代谢产物所引起的正常现象。试验过程中在固体培养基上长出的菌落呈圆形、透明、边缘整齐，在荧光显微镜下观察，有很强的荧光现象。试验结果表明，在严格的厌氧环境下，培养出来的菌落属于产甲烷菌群，经过筛选及滚管等操作，分离出来了产甲烷菌。
2.2低温产产甲烷菌的分离驯化
将两组培养液压片后用荧光显微镜观察发现，25℃培养下有大量蓝色荧光，用气相色谱检测培养瓶中的气体，发现有CH4气体的存在，8℃培养下，有少量荧光，用气相色谱分析，有CH4气体的存在，说明有耐低温的产甲烷菌存在。
2.3底物配比实验
根据试验所测结果，在猪粪：牛粪：羊粪：秸秆=2：1：2：1的比例下，产气量最大，且最大产气量比平均产气量67.2%高出20.1%。
在pH在大于或小于7时，甲烷菌的活性就会受到影响，产气量降低。TS浓度在低于8%时，产甲烷菌能够吸收的养分不足，高于8%时，由于代谢产物的积累，同样会降低产甲烷菌的产气量。当盐度在4%时，产甲烷菌产气量最大，高于4%，则使产甲烷菌活性降低，低于4%，则会影响其产气量。
2.4甲烷气增产试验
将猪粪、牛粪、羊粪、秸秆按2：1：2：1的比例作底物，初始PH为7.2，TS浓度为8%，盐度为4%，在厌氧操作箱中接种产产甲烷菌，于8℃的生化培养箱中培养，定期测定其10天，根据试验组生长曲线，在前三天产甲烷菌的产气量增加缓慢，是菌体生长的迟缓期，其后生长进入倍数期，产气量增加迅速，在第七天产产甲烷菌的产气量达到最大，其生长进入稳定期，产气量不再增加。
甲烷菌的生长受到碳氮元素的影响，增加培养液中的N素含量，促进了碳氮含量的合理配比，使产甲烷菌的产气速率显著增加。经计算，对照组的C：N=21.5：1，加尿素10%后，C：N=24：1，加尿素15%后，C：N=25.2：1，加尿素20%后，C：N=26.4：1。试验表明，在C/N比为25：1时，产甲烷菌生产的气体最大。
3结论
试验研究表明，原料配比及pH，TS浓度，盐度对发酵效果有显著影响，主要体现在产气含量的差异。在混合原料做底物时，其产气量比单独物料做底物时产气量要大，且在猪粪：牛粪：羊粪：秸秆=2：1：2：1时，产气量最大。发酵时，pH值对产气的影响最大，其次是TS浓度和盐度。在混合原料作底物时，沼气发酵最佳试条件为为pH为7.2，TS浓度为8%，盐度为4%的试验组。产甲烷菌生长的最佳C/N比为25：1。
参考文献：
[1]陆清忠，邓功成，等.农村沼气池接种低温驯化沼气发酵微生物试验.现代农业科技，2009（05）：268-271.
[2]刘德江，高桂丽，朱妍梅，等．猪粪、牛粪、羊粪沼气发酵比较试验[J]．塔里木大学学报，2005，17（2）：11－13．（inChinesewithEnglishabstract）.