丙型肝炎病毒Core和NS5A基因原核表达载体构建及蛋白纯化

论文摘要

目的丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）感染所致丙型肝炎是慢性肝病及肝细胞癌（hepatic cell cancer,HCC）的病因之一;但迄今尚无疫苗和特异有效的治疗方式。深入研究丙型肝炎病毒的感染与致病机制具有重大的现实意义。本文通过构建丙型肝炎Core和NS5A基因原核表达载体,获得高产量的纯化核心蛋白,再此基础上制备其多克隆及单克隆抗体。本研究通过模板PCR、酶切、转化、诱导、原核表达、蛋白纯化等几个方面来研究HCV Core和NS5A基因在HCC发病过程中的生物学功能。方法1:以HCV株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得核心蛋白Core基因,构建原核表达载体pET-32a（+）-HCV-Core。转化大肠埃希菌DH5α,提取质粒,验证正确后,再次转化大肠埃希菌BL21中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot验证融合蛋白的表达。超声破碎表达菌,Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。2:以HCV株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得NS5A基因,转化大肠埃希菌DH5α,提取质粒,验证正确后,与载体pET-32a（+）连接,再转化大肠埃希菌BL21中,构建原核表达载体pET-32a（+）-NS5A。IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Westernblot验证融合蛋白的表达。超声破碎表达菌,Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。结果1:Core和NS5A融合蛋白在原核表达系统分别成功表达。2:SDS-PAGE分析表明其为包涵体表达。3:通过Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性成功获得了Core和NS5A融合蛋白纯品。结论本研究成功利用大肠杆菌原核表达系统对丙型肝炎Core和NS5A基因进行了诱导表达,表达蛋白通过亲和层析技术进行了纯化。这些都为日后应用纯化蛋白制备具备高效价、高特异性的兔抗多克隆抗体,以及包括免疫组织化学、细胞增殖、细胞信号转导等方法深入研究Core和NS5A在丙型肝炎病毒展过程中的意义奠定了物质基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 插图或附表清单
• 注释说明清单
• 引言
• 第一章 丙型肝炎Core基因原核表达载体的构建及蛋白纯化
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 第二章 丙型肝炎NS5A基因原核表达载体的构建及蛋白纯化
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介及读研期间主要科研成果
• 附录