小麦成株抗条锈性及小种专化抗条锈性相关基因的表达谱分析

论文摘要

由Puccinia striiformis f.sp. tritic引起的小麦条锈病是世界范围内小麦（Triticum aestivum）生产上的重要病害。小麦成株抗性与小麦对条锈病的持久抗性有着密切的关系,是持久抗性的重要组成部分。为了对小麦成株抗性机制有更好的了解,我们采用抑制差减杂交的方法,选取条锈菌接种后12h,24h及36h的小麦材料及各时间点对照材料,构建了条锈菌诱导的成株期小麦“兴资9104”的基因表达谱。通过该实验,我们得到1250个阳性克隆,阳性克隆比例为68.5 %。对所有阳性克隆提取质粒DNA,经序列测定、去除载体序列及低质量序列后,共得到1188条高质量的ESTs。ESTs长度范围为100-800bp,多为100-400bp,其中17个序列长度大于600bp。对所有EST用Cap3软件进行聚类拼接,共获得427个Unigenes,包括245个Contigs和182个Singlets。多数congtigs包含2-3个序列,有一个contig包含了33个序列。经Blastx对所得Unigenes与NCBI非冗余蛋白质数据库进行比对分析和功能注释,发现在所有的Unigenes中,比对后没有显著性匹配（no hits）的占37.4%,这一类序列有可能是新的基因,也有可能是因为片段太短而造成没有匹配的序列。267个unigenes （62.6%）与蛋白质数据库中的序列存在着显著到极显著的相似性。在这267个ungenes中,232个表现出与已知功能序列的同源性,35个与未知功能序列具同源性。将已知功能的232个unigenes进行功能分类,其中防御相关的基因为第一大类,占已知功能基因的24%,其中胁迫相关的蛋白、病程相关蛋白及一些蛋白激酶出现的频率较高;占第二类的是与能量相关的基因,占15.7%,其中,参与光合作用及叶绿体结构建成的基因最多,如1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）,Rubisco活化酶;蛋白质合成及代谢相关的基因分别占13.1%和8.6%,居第三、四位;信号传导相关的基因占8.2%,膜转运类基因占6.4%,蛋白质修饰和储存类基因占3.4%,其它几类所占比例较小,分别是转录相关基因2.6%,编码次生代谢物质的基因2.2%,细胞生长分化相关基因1.9%,转座子0.7%。通过比较我们的实验结果与前人对小麦高温成株抗锈性及小麦条锈小种专化抗性的研究,我们认为小麦成株抗性的机制不同于小种专化抗性,表现在更多的防御途径参与了成株抗性的反应,并且活性氧相关的基因表达在成株抗性品种中产生较少或者是产生较晚。利用Real Time PCR检测技术,我们分析了一些抗病相关基因在接种后不同时间点的转录变化。结果表明,多数基因在成株期和苗期小麦的表达趋势基本一致,但在成株期的表达呈现诱导表达水平上升快,表达量高的特点。同时我们发现,大多数抗病相关基因在成株期未接种对照中的表达量高于苗期未接种对照。这很有可能是成株抗性产生的原因之一。小麦对条锈病的小种专化抗性是小麦抗病性的重要方面,在抗病育种中占有重要的地位。为了解小麦小种专化抗性的分子机制,我们利用寡核苷酸芯片对8个具小种专化抗性的单基因系的基因表达谱进行了分析,以期寻找具有相同遗传背景的单基因系中所共有的抗性机制及各个单基因系所特有的基因表达特征。通过对这八个单基因系的转录分析,我们鉴定了28个转录参与了所有基因型的小种专化抗性,其中19个为非亲和组合较未接种对照所特有的基因,包括假想的抗病蛋白,过氧化物酶、蓝铜结合蛋白、苯丙氨酸解氨酶及细胞色素P450等。另外9个基因为非亲和组合较亲和组合所特有的基因,包括钙调素结合蛋白、蓝铜结合蛋白、过氧化物酶及β-1,3-葡聚糖酶等等。同时我们也鉴定了每个基因型中特有的抗病相关的转录,这表明不同基因型有特定的转录事件产生。结果证实了已知的小种专化抗性中R基因介导的路径,包括氧化爆发,病程相关蛋白的表达及苯丙烷途径的活性。然而,还有几个为未知功能的转录,有待于进一步的研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦条锈病的发生、危害及现状
• 1.2 小麦抗病性的类型及研究进展
• 1.2.1 抗病性的类型
• 1.2.2 持久抗病性与成株抗病性
• 1.3 植物抗病的分子机制
• 1.4 小麦防卫相关基因及其研究进展
• 1.4.1 防卫相关基因的特点
• 1.4.2 防卫相关基因的主要类型
• 1.5 差异表达基因的研究方法
• 1.5.1 DDRT PCR 技术
• 1.5.2 cDNA 扩增片段长度多态性
• 1.5.3 抑制性差减杂交
• 1.5.4 cDNA 微阵列
• 1.6 研究内容及研究目标
• 参考文献
• 第二章 小麦成株抗条锈性抑制差减杂交文库构建及表达序列标签分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 RNA 提取及纯化
• 2.1.3 从总RNA 中分离polyA+RNA
• 2.1.4 抑制差减杂交
• 2.1.5 质粒文库的构建（T/A 克隆法）
• 2.1.6 测序
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 接种叶片反应型鉴定
• 2.2.2 总RNA 提取结果
• 2.2.3 抑制差减杂交检测结果
• 2.2.4 SSH cDNA 插入片段长度分析
• 2.2.5 ESTs 获得与分析
• 2.2.6 差异表达基因的电子定位
• 2.3 讨论
• 2.3.1 抗病相关EST 分析
• 2.3.2 与同类研究的比较
• 第三章 小麦抗病相关候选基因的表达分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试材料
• 3.1.2 试剂及仪器
• 3.1.3 RNA 提取及反转录
• 3.1.4 PCR 引物设计
• 3.1.5 半定量PCR
• 3.1.6 Real Time PCR
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 条锈菌与小麦互作过程中信号传导途径关键酶基因的表达分析
• 3.2.2 条锈菌与小麦互作过程中防卫相关基因的表达分析
• 3.2.3 条锈菌与小麦互作过程中未知功能基因的转录分析
• 3.2.4 Real Time PCR 检测抗病相关基因的表达模式
• 3.3 基因功能的讨论
• 第四章 利用基因芯片对小麦条锈小种专化抗性的转录分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 供试材料
• 4.1.2 试验设计
• 4.1.3 芯片设计
• 4.1.4 RNA 的提取
• 4.1.5 单链cDNA 的获得
• 4.1.6 预杂交
• 4.1.7 杂交
• 4.1.8 信号扩大
• 4.1.9 数据分析
• 4.1.10 利用 Real Time PCR 对所得结果进行验证
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 反应型鉴定
• 4.2.2 数据分析
• 4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介