鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ型菌毛对细菌及其所携带抗原GFP诱导小鼠免疫反应的影响研究

论文摘要

沙门氏菌是条件性细胞内寄生菌,分类上属于肠杆菌科沙门氏菌属,能引起人和动物的伤寒、副伤寒和急性胃肠炎等多种疾病。沙门氏菌也是世界上引起食物中毒最多的病原菌,在医学、兽医学和公共卫生学上都有十分重要的意义。鼠伤寒沙门氏菌是引起人和动物沙门氏菌病的主要血清型,是沙门氏菌病研究的模式细菌。沙门氏菌的菌毛是其表面的纤细结构,与细菌黏附上皮细胞及在小肠粘膜的定殖有关。表达Ⅰ型菌毛的鼠伤寒沙门氏菌在小鼠各组织脏器内的定殖能力高于不表达Ⅰ型菌毛的细菌。体外试验表明Ⅰ型菌毛能特异性介导沙门氏菌对骨髓源树突状细胞的黏附和侵袭,该树突状细胞的表型与小肠Peyer氏结的树突状细胞亚群相近。鉴于树突状细胞强大的免疫提呈功能,Ⅰ型菌毛的表达有可能增强机体对沙门氏菌及其所携带的外源抗原的免疫反应。本研究即基于此推论,探讨了Ⅰ型菌毛对鼠伤寒沙门氏菌及其所携带外源抗原的免疫反应的影响。主要研究内容如下:1.构建了表达绿色荧光蛋白（GFP）和含Ⅰ型菌毛基因簇的鼠伤寒沙门氏菌AZB109-p44h-gfp、AZB117-p44h-gfp,和表达GFP但不含Ⅰ型菌毛基因簇的鼠伤寒沙门氏菌AZB109-p33h-gfp、AZB117-p33h-gfp。研究证实重组沙门氏菌能表达GFP,且表达的GFP均具有免疫原性。菌毛抗体凝集试验证实AZB117-p44h-gfp能够表达Ⅰ型菌毛,而AZB109-p44h-gfp未表达Ⅰ型菌毛。另两株不含Ⅰ型菌毛基因簇的重组细菌不表达Ⅰ型菌毛。2.将重组菌AZB109-p33h-gfp（fim-）和AZB109-p44h-gfp分别通过口服和腹腔注射途径免疫小鼠,检测了小鼠的体液和粘膜免疫反应。重组菌产生的血清IgG和肠道IgA水平没有显著差异。3.将重组菌AZB117-p33h-gfp（fim-）和AZB117-p44h-gfp（fim+）通过口服途径免疫小鼠,检测了小鼠的免疫反应。表达Ⅰ型菌毛的沙门氏菌免疫小鼠产生的针对沙门氏菌及其所携带外源抗原GFP的血清抗体水平和细胞免疫水平均显著高于不表达Ⅰ型菌毛的沙门氏菌免疫组小鼠。二免后4周,沙门氏菌血清IgG平均滴度分别为9625和2960;沙门氏菌抗原刺激的IFN-γ浓度分别为990 pg/ml和106 pg/ml。二免后4周抗GFP血清IgG平均滴度分别为2400和150;GFP刺激的IFN-γ浓度分别为186 pg/ml和8pg/ml。4.皮下注射方式免疫重组菌AZB117-p33h-gfp（fim-）和AZB117-p44h-gfp（fim+）时,表达Ⅰ型菌毛的沙门氏菌AZB117-p44h-gfp（fim+）免疫小鼠产生的针对沙门氏菌的血清抗体水平和粘膜抗体IgA水平均显著高于不表达Ⅰ型菌毛的沙门氏菌免疫组。二免后2周IgG平均滴度分别为3240和314;二免后4周分别为41600和18844。但针对沙门氏菌的细胞免疫水平与无Ⅰ型菌毛表达的沙门氏菌免疫组没有显著差异,沙门氏菌抗原刺激的IFN-γ浓度分别为3166pg/ml和2923pg/ml。表达Ⅰ型菌毛的沙门氏菌免疫小鼠产生的针对其所携带外源抗原GFP的血清IgG水平显著低于不表达Ⅰ型菌毛的沙门氏菌免疫组,二免后4周平均滴度分别为4800和40000;细胞免疫水平则略低于不表达Ⅰ型菌毛的沙门氏菌免疫组,GFP刺激的IFN-γ浓度分别为1953pg/ml和2631pg/n’d,差异不显著。5.皮下注射途径免疫重组菌AZB117-p33h-gfp（fim-）和AZB117-p44h-gfo（fim+）诱导小鼠产生的的体液免疫和细胞免疫水平均显著高于口服免疫途径。6.腹腔注射途径免疫重组菌AZB109-p33h-gfp（fim-）和AZB109-p44h-gfp（fim+）诱导小鼠产生的的体液免疫水平与口服免疫途径没有显著差别。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词（Abbrevitation）
• 1 文献综述
• 1.1 沙门氏菌病的流行现状与危害
• 1.2 沙门氏菌的特征
• 1.3 沙门氏菌菌毛
• 1.3.1 沙门氏菌菌毛的类型
• 1.3.2 沙门氏菌菌毛在细菌致病中的作用
• 1.4 鼠伤寒沙门氏菌对机体的感染与免疫
• 1.5 沙门氏菌I型菌毛与树突状细胞的相互作用
• 1.6 沙门氏菌疫苗
• 1.7 沙门氏菌疫苗载体
• 1.8 绿色荧光蛋白（GFP）
• 2 研究目的和意义
• 2.1 为深入研究沙门氏菌致病机理提供依据
• 2.2 为设计更加安全高效的沙门氏菌疫苗载体提供理论依据
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 药品与试剂
• 3.1.3 抗体与细胞因子检测试剂盒
• 3.1.4 主要培养基及其配制
• 3.1.5 主要试剂与缓冲液的配制
• 3.1.6 本实验所用PCR引物
• 3.1.7 实验动物
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 重组沙门氏菌的构建
• 3.2.1.1 GFP基因的PCR扩增与检测
• 3.2.1.2 PCR产物的回收与纯化
• 3.2.1.3 PCR产物在T载体上的克隆
• 3.2.1.4 重组质粒的鉴定
• 3.2.1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 3.2.1.6 连接产物的转化
• 3.2.1.7 质粒的制备
• 3.2.1.8 重组质粒的构建
• 3.2.1.9 重组菌的构建
• 3.2.1.10 沙门氏菌的电转化
• 3.2.1.11 SDS-PAGE
• 3.2.1.12 Western-blot
• 3.2.1.13 沙门氏菌菌毛检测
• 3.2.2 GFP的原核表达与纯化
• 3.2.2.1 原核表达载体的构建
• 3.2.2.2 GFP的原核表达
• 3.2.2.3 GFP的纯化
• 3.2.2.4 GFP免疫原性检测
• 3.2.3 重组沙门氏菌对小鼠的接种剂量确定试验
• 3.2.4 小鼠的免疫试验
• 3.2.4.1 免疫程序
• 3.2.4.2 细菌计数
• 3.2.4.3 ELISA方法测定抗体滴度
• 3.2.4.4 小鼠脾淋巴细胞分离
• 3.2.4.5 脾淋巴细胞增殖反应试验
• 3.2.4.6 IFN-γ的定量检测
• 3.2.4.7 IL-4的定量检测
• 3.2.4.8 统计学分析
• 4 结果与分析
• 4.1 GFP在大肠杆菌中的表达
• 4.1.1 GFP基因的扩增与克隆
• 4.1.2 原核表达质粒pET-28a-gfp的构建
• 4.1.3 GFP在大肠杆菌中的表达与检测
• 4.2 沙门氏菌重组菌的构建与鉴定
• 4.2.1 GFP基因的扩增与克隆
• 4.2.2 重组质粒p33h-gfp与p44h-gfp的构建
• 4.2.3 重组沙门氏菌的构建
• 4.3 重组沙门氏菌接种小鼠的剂量确定
• 4.4 AZB109-p33h-gfp、AZB109-p44h-gfp接种小鼠的免疫反应
• 4.4.1 沙门氏菌IgG抗体水平检测
• 4.4.2 沙门氏菌sIgA抗体水平检测
• 4.4.3 GFP抗体水平检测
• 4.5 AZB117-p33h-gfp、AZB117-p44h-gfp口服接种小鼠的免疫反应
• 4.5.1 沙门氏菌IgG抗体水平检测
• 4.5.2 沙门氏菌sIgA抗体水平检测
• 4.5.3 沙门氏菌抗原刺激的淋巴细胞增殖分析
• 4.5.4 沙门氏菌抗原刺激的IFN-γ检测
• 4.5.5 沙门氏菌抗原刺激的IL-4检测
• 4.5.6 抗GFP的IgG抗体水平检测
• 4.5.7 GFP刺激的淋巴细胞增殖分析
• 4.5.8 GFP刺激的IFN-γ检测
• 4.5.9 GFP刺激的IL-4检测
• 4.6 AZB117-p33h-gfp、AZB117-p44h-gfp经皮下注射途径接种小鼠的免疫反应
• 4.6.1 沙门氏菌IgG抗体水平检测
• 4.6.2 沙门氏菌sIgA抗体水平检测
• 4.6.3 沙门氏菌IgM抗体水平检测
• 4.6.4 沙门氏菌抗原刺激的淋巴细胞增殖分析
• 4.6.5 沙门氏菌抗原刺激的IFN-γ检测
• 4.6.6 沙门氏菌抗原刺激的IL-4检测
• 4.6.7 抗GFP的IgG抗体水平检测
• 4.6.8 抗GFP的IgM抗体水平检测
• 4.6.9 GFP刺激的淋巴细胞增殖分析
• 4.6.10 GFP刺激的IFN-γ检测
• 4.6.11 GFP刺激的IL-4检测
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢