论文摘要
本课题受南方医科大学南方医院2005年度院长基金支助。世界卫生组织（WHO）曾在2001年发布警告，全球肺癌发病率每年以22％的速度飞速增长，年新增病人达135万人，位居恶性肿瘤第1位。而乳腺癌的发病率一直居女性肿瘤的首位，每年以2％的速度递增，年新增病人约120万人，预计2010年将达到140万。中国肿瘤防治研究办公室2007年公布的恶性肿瘤的发病现状和趋势分析表明，我国年新增肺癌病人约50万人，男女年增长率分别为26．9％和38．4％，居恶性肿瘤之首。而乳腺癌年新增病例大约20万人，且在我国的年增长速度高出高发国家1～2％，是威胁我国女性健康的头号杀手[1-3]。放射治疗是肺癌、乳腺癌最主要的治疗手段之一，大约70％的病人需要行放射治疗[4]。随着放射治疗技术的改善，肺癌、乳腺癌病人的中位生存期、五年生存率也得到极大的提高。然而，随着病人生存时间的延长，对肿瘤治愈后生活质量的需求增高，胸部放射治疗的迟发损伤——放射性肺损伤也随之成为关注的焦点。放射性肺损伤是肺癌、乳腺癌等胸部恶性肿瘤放射治疗最常见、最严重的副作用之一，常常发展为不可逆的严重的肺纤维化，是影响放射治疗疗效的主要限制因素之一。近20年来，人们对放射性肺损伤的发病机制和诊治水平有了较大的提高，但放射性肺损伤的发生率和由于放射性肺损伤导致的病死率仍未得到有效的控制，给患者的家庭和社会带来了沉重的负担。因此，我们迫切需要深入了解放射性肺损伤的发生机制，寻找阻滞或逆转放射性肺损伤发生发展的靶点，为临床寻找新的药物提供理论和实验依据。放射性肺损伤包括肺间质炎症和肺纤维化两个阶段，而肺纤维化是其中的一个关键特征。肺纤维化过程包括肺组织的炎性损伤、组织结构破坏以及肺间质细胞积聚的组织修复过程。在此过程中，肺间质细胞（如成纤维细胞（Fibroblast，FB））、肺炎症细胞（主要为单核巨噬细胞）、肺泡上皮细胞、内皮细胞和细胞因子、炎性介质等生物活性物质相互作用，发挥直接或间接作用[5]。随着对放射性肺损伤细胞与分子生物学的深入研究，发现肺FB在照射后转化为肌纤维母细胞（Myofibroblast，MF），后者是肺纤维化过程最活跃的细胞，是肺纤维化进展过程中细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的主要来源，兼具FB和平滑肌细胞的性质；分泌大量生长因子、细胞因子和炎性介质，在复杂的细胞网络中传递信息并诱导其他细胞的凋亡和分化；MF在肺纤维化过程中凋亡受到抑制呈持续增殖状态，可能是导致肺纤维化进行性发展的关键环节。由此，我们设想如果以肺MF为治疗靶点，通过①干预分泌生长因子及其受体或下游信号传导，阻断FB群活化扩增；②破坏胶原及其它ECM成份分泌合成；③诱导MF凋亡，阻止MF过度增殖[6]，可能将有效防治放射性肺损伤的发生，减少放射性肺损伤的严重程度和病死率（图1）。然而，目前治疗放射性肺纤维化的药物仍以糖皮质激素为主，用量大，疗效不理想，且长期使用毒副作用大，病人往往难以耐受。因此我们迫切需要深入探讨照射后肺FB活化、凋亡、分泌机制，在放射性肺损伤发生过程的重要意义，为寻找安全有效的治疗靶点提供理论和实验依据。为了进一步证实肺FB活化、凋亡、分泌机制在放射性肺损伤的发生发展过程中动态改变及重要作用，为放射性肺损伤的防治寻找新的靶点，我们建立了Wistar大鼠半胸照射的放射性肺损伤实验动物模型，①观察照射后肺FB的光镜下特点；②通过免疫组化寻找证实照射后肺FB活化的证据；③通过免疫组化证实照射后的FB细胞具有分泌的功能；④照射后肺FB的凋亡特点；④通过以IFN-γ干预，寻找可能预防放射性肺损伤的药物。主要结果及结论如下：v1)以30GyX射线单次照射Wistar大鼠右肺，发现照射后肺组织FB免疫组化a-SMA呈强阳性，与对照组有显著差异（P<0．05），证实肺FB照射后活化成为功能活跃的MF；（2）Wistar大鼠单侧肺照射30Gy后，对侧未照射肺组织的也可见散在分布梭形样形态的间质细胞，免疫组化提示表达a-SMA，证实为MF。统计分析表明未照射肺组织在照射后a-SMA的表达与正常对照组有显著差异性（P=0．001）。由此猜测具有增殖和分泌活性的MF可能有部分来源于肺外，通过血液传递分布于肺组织照射野内或野外，可能参与了淋巴细胞性放射性肺损伤的发生；（3）Wistar大鼠照射后肺FB转化成MF的同时，免疫组化提示细胞内TGF-β、MMP9呈阳性表达，证实了照射后活化的MF具有分泌功能。结合FB活化通路的分析，TGF-β是诱导FB活化的最重要生物介质之一，MF的这种自分泌作用可能放大了FB的活化，促进放射性肺炎和肺纤维化的形成，因此，阻断TGF-β通路，阻断FB的活化，可能为减少照射后肺间质炎症和纤维化的程度带来新的希望；（4）照射后肺内MF也存在类似的凋亡抵抗作用，其凋亡抑制基因Bcl-2表达增强，而凋亡诱导基因Bax表达减弱，这说明肺FB细胞活化成为MF后，细胞由于凋亡抵抗作用，增殖能力大大增加，导致了成纤维细胞的堆积，加之MF分泌的MMP-9破坏了肺泡细胞基底膜，更加有利于增殖的成纤维细胞向肺泡内迁徙，从而导致了肺泡的塌陷，不可逆的放射性肺纤维化形成。如果以肺MF为治疗靶点，寻找安全有效的诱导肺MF凋亡的药物，可能是防治放射性肺损伤的新方向；（5）照射后连续皮下注射IFN-γ5万单位／日×8周，照射+药物组较单纯照射组明显减少了FB表达α-SMA，从而阻止了肺FB活化成为活性较强的MF，抑制了MF的过度增殖。而形态学研究也发现药物组能明显推迟肺纤维化的发生时间，降低肺纤维化程度。而TGF-β表达的下降，暗示IFN-γ可能是通过抑制TGF-γ／Smad通路的信号传导，从而达到抑制α-SMA表达的作用，其作用机制尚需进一步的分子生物学研究。