银杏叶制剂对哮喘T淋巴细胞及其与PKC关系影响的研究

论文摘要

前言在众多的发病机制中，有T淋巴细胞参与的慢性气道炎症是公认的哮喘重要的发病机制之一。T淋巴细胞（主要是Th2细胞）的活化、增殖和分泌大量的细胞因子（如：IL-4、IL-5等）在哮喘的发生、发展中起着重要作用。而在T淋巴细胞活化、增殖和分泌细胞因子促进炎性介质释放的过程中，细胞信号转导通路的作用十分重要，其中尤以蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）信号转导通路的作用最引人注目。PKC是一个具有广泛生物学活性的酶，先前的研究表明PKC家族的重要成员PKCα活性的变化在T淋巴细胞活化、增殖和分泌细胞因子的过程中起着重要作用。糖皮质激素是目前治疗哮喘气道炎症的最强大最有效的药物，但临床应用显示其也有缺点和局限性，寻找新的有效治疗气道炎症的药物对提高哮喘的总体治疗效果具有一定的临床意义。银杏叶提取物的化学成分复杂，其主要活性成分银杏黄酮和萜内酯现已广泛应用于心脑血管系统疾病的治疗；在呼吸系统方面的治疗作用，特别是在哮喘的治疗方面早有记载。迄今为止，较多的临床研究证实银杏制剂对哮喘有确切的疗效，其对哮喘患者T淋巴细胞功能及其与PKCα关系的影响如何目前尚无报道。因此，将银杏叶制剂对哮喘T淋巴细胞功能及其与PKCα关系的影响进行系统地的研究，对银杏叶制剂治疗哮喘的临床效果和部分作用机理进行深入的探讨，明确其对哮喘的疗效及部分可能的作用机理，对于改善哮喘疗效和预防复发有一定的临床意义。第一部分银杏叶制剂对哮喘外周血T淋巴细胞PKC表达及Th1／Th2类细胞因子分泌影响的研究分题一银杏叶制剂对哮喘大鼠T淋巴细胞体外增殖和凋亡的影响目的检测不同银杏叶制剂在体外对T淋巴细胞增殖和凋亡的影响，探讨银杏叶制剂治疗哮喘的部分机理。方法将14只大鼠分成2组（健康对照组7只；哮喘组7只），分别采集外周血，并分离出T淋巴细胞，体外分组培养（分空白组、银杏叶制剂BN-52021组、银杏叶制剂EGb761组），各组分别以不同浓度的BN-52021和EGb761干预不同时间。之后，用MTT法分别测定各组细胞的增殖情况；用Annexin V／PI双染法流式细胞仪测定BN-52021不同浓度组的细胞凋亡情况。结果与空白组比较，EGb761在低浓度时促进T淋巴细胞增殖，而高浓度时则起抑制作用（均P＜0.05）；BN-52021对体外培养的哮喘和健康大鼠T淋巴细胞的增殖均有抑制作用，其作用强度（在一定的范围内）随剂量的增加和时间的延长而加强（组间比较均P＜0.05）；但对哮喘大鼠的抑制作用要明显强于健康大鼠（P＜0.05）；T淋巴细胞的凋亡率随BN-52021浓度的增加而增加（P＜0.01）。结论银杏叶制剂因其成分和干预浓度的不同而对体外培养的大鼠T淋巴细胞增殖活性的影响不同，对哮喘与健康大鼠T淋巴细胞的作用也有差异，银杏内酯B可能是抑制T淋巴细胞增殖的主要活性成分，其不仅可抑制T淋巴细胞的体外增殖，而且还可增加T淋巴细胞的凋亡率。分题二哮喘大鼠外周血T淋巴细胞Th1／Th2细胞因子和PKCα的表达及银杏叶制剂对它们的影响目的探讨银杏叶制剂对在哮喘大鼠免疫学发病机制中起关键作用的T淋巴细胞部分生物学功能的影响情况。方法将14只SD大鼠随机分成哮喘和正常两组，每组7只。从每只大鼠外周血分离出T淋巴细胞，分组培养72小时后，分别用逆转录—聚合酶链式反应（Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）检测各组IL-2、IL-4、IL-5 mRNA的表达量和Western Blot检测各组细胞膜与细胞浆PKCα的表达比率。结果IL-2、4、5 mRNA表达量在哮喘组均明显高于正常组，各因子两组间比较差异有显著性（P＜0.01）；哮喘组T淋巴细胞给予BN-52021干预后IL-2、4、5mRNA的表达量明显下降；正常组IL-2／IL-4mRNA的比值较哮喘组高，两组比较有显著差异（P＜0.01），其中哮喘组给予BN-52021干预后比值有所增大，与未干预组比较有明显变化（P＜0.01）。哮喘PMA+BN-52021干预组IL-2、4、5mRNA表达量，明显低于哮喘PMA干预组（P＜0.05），但高于PMA+Ro31-8220组（P＜0.05），而PMA+Ro31-8220组与PMA+Ro31-8220+BN-52021干预组比较无明显差异（P＞0.05）。哮喘空白组PKCα在T淋巴细胞胞膜与胞浆的表达量比率显著高于正常对照组（P＜0.01），BN-52021干预后哮喘组比率较未干预组明显下降（P＜0.05），PMA+BN-52021干预组PKCα比率为较PMA干预组1.28±0.28低（P＜0.05）；哮喘各组T淋巴细胞胞膜与胞浆PKCα表达量的比率与IL-4mRNA表达量的相关性分析显示呈明显正相关（n=42，r=0.845，P＜0.01）。结论银杏叶制剂对体外培养的哮喘大鼠T淋巴细胞因子IL-2、4、5的分泌均具有抑制作用，而对IL-2分泌的抑制作用相对较弱；银杏叶制剂对哮喘大鼠T淋巴细胞胞膜与胞浆PKCα的表达量比率具有明显的下调作用；其对T淋巴细胞因子及Th1／Th2细胞因子平衡的影响，可能是通过影响PKC信号转导途径起作用。分题三PKCα对哮喘患者外周血T淋巴细胞IL-2、IL-4、IL-5mRNA表达的调节以及银杏叶提取物对其的影响目的了解银杏叶制剂对哮喘患者免疫学发病机制中起关键作用的T淋巴细胞部分生物学功能的影响情况，探讨其治疗哮喘的可能机制。方法从12位哮喘患者和10位健康对照者静脉采取外周血10ml，分离出T淋巴细胞并进行分组培养（A组：空白组，B组：PMA干预组，C组：BN-52021干预组，D组：PMA+BN-52021干预组，E组：PMA+PKC抑制剂（Ro31-8220）干预组，F组：PMA+Ro31-8220+BN-52021干预组）。体外培养72小时后分别用Western Blot检测各组细胞膜与细胞浆PKCα表达比率和RT-PCR检测各组细胞IL-2、4、5mRNA的表达量。结果哮喘组IL-2、4、5mRNA表达量明显高于正常组，各因子两组间比较差异有显著性（P＜0.01）；哮喘组T淋巴细胞给予BN-52021干预后IL-2、4、5mRNA的表达量明显下降（均P＜0.05）；正常组IL-2／IL-4mRNA的比值高于哮喘组，两组比较有显著差异（P＜0.01），给予BN-52021干预后哮喘组比值有所增大，与干预前比较有明显变化（P＜0.01）。哮喘PMA+BN-52021组IL-2、4、5mRNA表达量明显低于PMA干预组（P＜0.05），高于PMA+Ro31-8220组（P＜0.05），而PMA+Ro31-8220组与PMA+Ro31-8220+BN-52021干预组比较无明显差异（P＞0.05）。哮喘空白组PKCα在T淋巴细胞胞膜与胞浆表达量的比率显著高于正常对照组（P＜0.01），BN-52021干预后哮喘组比率较干预前明显下降（P＜0.05），PMA+BN-52021干预组PKCα比率较PMA干预组低（P＜0.05）；哮喘组T淋巴细胞胞膜与胞浆PKCα表达量的比率与IL-4、5mRNA表达量的相关性分析呈明显正相关（分别r=0.885；r=0.938，均n=132，P＜0.01）。结论银杏叶制剂对体外培养的哮喘患者T淋巴细胞因子IL-2、4、5的分泌均具有抑制作用，而对IL-2分泌的抑制作用相对较弱；银杏叶制剂对哮喘患者T淋巴细胞胞膜与胞浆PKCα表达比率具有明显的下调作用；其可能通过影响PKC信号转导途径而进一步影响IL-4、5等Th2细胞因子的分泌及Th1／Th2细胞因子的平衡。第二部分银杏叶制剂对PKC在哮喘气道炎性细胞中的表达及其对气道中部分Th2类细胞因子浓度影响的研究分题一银杏叶制剂对哮喘大鼠气道炎性细胞蛋白激酶Cα表达及白细胞介素-4分泌的影响目的探讨银杏叶提取物（Extract of Ginkgo biloba，EGb）对哮喘大鼠气道炎症的治疗效果及可能机制。方法48只SD大鼠按数字随机法均分成8组：正常对照组、哮喘组（此组再分为：未处理组、激素1周组、激素2周组、激素4周组、EGb1周组、EGb2周组、EGb4周组）。采用Wright’s染色法分类计数肺泡灌洗液中各类炎性细胞的相对数，免疫组化（SP法）测定PKCα在各组大鼠肺泡灌洗液炎性细胞中的表达情况，ELISA法测定肺泡灌洗液上清中IL-4的含量。结果哮喘未处理组大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞相对计数百分比、PKCα在淋巴细胞和总的细胞中的阳性表达率以及上清液中IL-4含量均显著高于正常对照组（P＜0.05）。激素处理不同时间组与未处理组间比较前述各指标明显下降（均P＜0.05）。EGb处理1、2周组相应指标明显高于激素处理组（P＜0.05）；EGb处理4周组与激素处理组比较无明显差异。EGb处理1周组与哮喘未处理组比较相应检测指标无明显差异（P＜0.05），EGb处理2周组相关检测指标明显低于EGb处理1周组（P＜0.05），但明显高于EGb处理4周组（P＜0.05）。EGb处理组炎性细胞PKCα阳性表达率与上清液中IL-4、嗜酸性粒细胞及淋巴细胞的相对计数百分比明显相关（n=18，r值分别为0.641、0.699、0.625，均P＜0.01）。结论EGb可减轻气道EOS和淋巴细胞等炎性细胞的浸润以及气道炎性细胞PKCα的阳性表达率和IL-4的分泌量，其作用弱于糖皮质激素，但随着药物治疗时间的延长其药理作用逐渐明显。其治疗哮喘的作用可能与其减少炎性细胞PKCα的表达进而降低EOS和淋巴细胞在气道的浸润以及IL-4的浓度有关。分题二吸入激素对哮喘患者诱导痰炎性细胞中PKCα表达及IL-5浓度的影响目的了解哮喘患者气道炎性细胞中PKCα的表达及TL-5的分泌情况，探讨它们与气道炎症的关系以及吸入激素对它们的影响。方法29例哮喘患者分2组：激素2周组（14例）、激素4周组（15例），治疗并随访，在治疗前后行诱导痰和肺功能检查，另选14名健康者为对照组。采用免疫组化（SP法）测定PKCα在诱导痰炎性细胞中的表达，ELISA法测定诱导痰上清中IL-5的含量。结果治疗前哮喘患者诱导痰中嗜酸性粒细胞和淋巴细胞相对计数、炎性细胞中PKCα阳性表达率和IL-5含量均高于健康组（P＜0.05），治疗后同组比较均明显下降（P＜0.01），FEV1占预计值的百分比的变化与它们的变化呈明显负相关（P＜0.05）；嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的相对百分比与IL-5和炎性细胞PKCα阳性表达率显著相关（P＜0.01）。结论吸入激素可明显降低气道IL-5的含量，其机制可能是通过抑制PKCα的表达来发挥作用。分题三银杏叶提取物对哮喘患者诱导痰炎性细胞中PKCα表达及IL-5浓度的影响目的探讨银杏叶提取物对哮喘患者的疗效及可能机制。方法75例哮喘患者随机分4组：激素2周组20例、激素4周组20例、激素+银杏叶制剂2周组18例、激素+银杏叶制剂4周组17例，治疗并随访，在治疗前后行诱导痰及肺功能检查，另选15名健康者为对照。采用瑞氏染色法对诱导痰中细胞进行分类计数，SP法测定PKCα在诱导痰炎性细胞中的表达，ELISA法测定诱导痰上清中IL-5的含量。结果治疗前哮喘患者诱导痰中EOS和淋巴细胞相对计数百分比、炎性细胞PKCα总阳性表达率和IL-5含量均显著高于健康组，FEV1占预计值的百分比显著低于健康对照组（均P＜0.05）。治疗后除FEV1占预计值的百分比较治疗前增加外，哮喘组其它相应指标较治疗前明显下降（P＜0.05），但仍高于健康对照组（P＜0.05）。与激素治疗2周组比较，银杏叶制剂+激素治疗2周组EOS、淋巴细胞、诱导痰上清中IL-5浓度及各类炎性细胞PKCα阳性表达率均无明显降低（P＞0.05）；但银杏叶制剂+激素治疗4周组与激素治疗2、4周组比较相应指标有明显降低（P＜0.05）。IL-5与诱导痰中炎性细胞PKCα总阳性表达率和EOS的相对百分比明显正相关（分别r=0.83，r=0.76，均n=150，P＜0.01）；FEV1占预计值的百分比与诱导痰炎性细胞PKCα总阳性表达率及IL-5的含量呈明显负相关（分别r=-0.77，r=-0.64，均n=150，P＜0.01）。结论银杏叶制剂可明显降低气道EOS、淋巴细胞等炎性细胞在气道的浸润，对哮喘气道炎症具有明显的改善作用；其部分机制可能通过影响气道炎性细胞PKCα的活性进而降低气道IL-5等细胞因子的浓度而发挥作用；其药理作用与糖皮质激素可能具有一定的互补性，但作用效果相对缓慢。

论文目录

• 一、论文摘要
• 1.中文摘要
• 2.英文摘要
• 二、论文正文
• （一） 第一部分:银杏叶制剂对哮喘外周血T淋巴细胞PKC表达及Th1/Th2类细胞因子分泌的影响
• 分题1 银杏叶制剂对哮喘大鼠T淋巴细胞体外增殖和凋亡的影响
• 分题2 哮喘大鼠外周血T淋巴细胞Th1/Th2细胞因子分泌和PKCα的表达及银杏叶制剂对它们的影响
• 分题3 PKCα对哮喘患者外周血T淋巴细胞IL-2、IL-4、IL-5 mRNA的表达的调节以及银杏叶提取物对其的影响
• （二） 第二部分:银杏叶制剂对支气管哮喘气道T淋巴细胞PKC及Th2类细胞因子表达的影响
• 分题1 银杏叶制剂对哮喘鼠气道T淋巴细胞PKCα及Th2类细胞因子表达的影响
• 分题2 吸入激素对哮喘患者诱导痰炎性细胞中PKCα表达及IL-5浓度的影响
• 分题3 银杏叶提取物对哮喘患者诱导痰炎性细胞中PKCα表达及IL-5浓度的影响
• 三、综述
• 综述一
• 综述二
• 四、致谢