新型胶原真皮支架的制备及其纯度测定与性能检测

论文摘要

近年来皮肤组织工程的出现为改善创面修复质量、解决皮源不足等问题提供了崭新的思路和方法。其中,真皮支架作为细胞外基质,为细胞提供了黏附、生长、迁移、增殖和分化的环境,在人工皮肤的构建中起着关键作用,一直是皮肤组织工程研究的重点。近年来,关于用猪的皮肤制备脱细胞真皮基质作为真皮支架用于构建人工皮肤已成为研究的热点。但由于制备思路的局限与制备工艺的不足,目前脱细胞真皮基质存在着免疫原性强、渗透性差、生物活性低等缺点。针对以上不足,本论文以组织工程学原理为指导,在前期研究的基础上以及综合考虑理想真皮支架的要求,采用新的制备工艺和多种化学、生物与物理综合方法强化处理乳猪皮,制备一种不同于现有ADM、具有天然三维网络结构的新型胶原真皮支架,重点研究了戊二醛交联与碱膨胀的次序、戊二醛用量、酶用量与酶处理时间对支架材料理化性能的影响,优化了关键制备工艺和胶原纯度的测定方法,并对其主要性能进行检测。主要研究内容和结果如下:（1）研究了戊二醛交联与碱膨胀的次序、戊二醛用量、酶用量和处理时间对支架材料理化性能的影响,实验结果显示:先交联保护、后碱膨胀的支架材料的孔隙率和透水汽性能要高于先碱膨胀、后交联的支架材料,故本实验选定先交联、后碱膨胀;随着戊二醛用量的增加,支架材料拉伸强度和收缩温度明显升高,体外降解时间明显延长,而孔隙率、透水汽性能和亲水性随着戊二醛用量的增加有所降低,但降低的幅度都不是很大;随着酶用量的增大及作用时间的延长,支架材料的孔隙率提高,透水汽性增强。（2）采用比色法测定新型胶原真皮支架中的胶原含量,并对其水解工艺条件进行优化,实验结果显示:新型胶原真皮支架最佳水解条件为每50mg干燥样品加入6mol/L盐酸10mL,100℃水解32h;此方法操作简单,测得结果的变异系数为0.3759%,说明具有较好的重现性;新型胶原真皮支架的胶原含量均高达90%以上,高于军事医学科学院装备研究所制备的胶原海绵支架（约74%）,说明本实验制备的真皮支架中的表皮、脂肪和纤维间质等非胶原成分去除得比较彻底。（3）以组织工程原理为指导,依据（1）、（2）的研究结果,结合现有材料的优点以及理想真皮支架材料的要求,制备出一种不同于现有ADM、具有天然真皮三维网络多孔结构的新型胶原支架,对其主要性能进行检测。研究结果显示:新型胶原真皮支架呈乳白色,表面平整光滑,无肉眼可见的杂物和变色,经戊二醛交联后,其质地明显变韧,颜色变黄:光镜检测结果显示真皮内的细胞成分已被去除掉,胶原纤维束保存完好;SEM观察结果显示支架材料的表面有大小不同的孔分布,且与支架内部相通,纤维束保持了其原有的天然三维网络结构并得到了适当的松散,支架内部具有丰富的多孔结构;其pH值在6.5～7.5范围内,符合人体液pH值范围;其孔隙率为70%左右,具有良好的孔隙率;其透水汽性能为2900g·m-2·24h-1左右,适合创面恢复;其拉伸强度介于10.15～11.56MPa之间,完全满足临床移植的要求;体外降解时间处于15～70h之间,并可根据需要采用交联剂进行调整,从而满足不同支架材料降解速率的要求;MTT法测定其细胞毒性为1级,符合植入人体生物材料的细胞毒性要求;细胞培养结果表明其具有良好的细胞相容性,可以有效促进细胞的黏附、增殖和生长。本论文制备的新型胶原真皮支架充分除去了表皮、脂肪及纤维间质,弱化胶原支架的抗原性,并用戊二醛适度交联,使其具有了高渗透性、良好的拉伸强度、适宜的降解时间、低免疫原性和良好的生物相容性,基本满足理想真皮支架的要求,为其今后的临床研究与应用奠定了良好的基础,有望用于复合移植和构建组织工程皮肤等领域。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 绪论
• 1 前言
• 2 真皮支架研究进展
• 2.1 合成材料类真皮支架
• 2.2 天然材料类真皮支架
• 2.3 理想真皮支架的要求
• 3 本论文的研究目的、意义和内容
• 4 本论文的主要技术路线
• 第二章 新型胶原真皮支架的制备新工艺探索
• 1 前言
• 2 实验部分
• 3 结果和讨论
• 3.1 交联与碱膨胀次序对支架材料孔隙率和透水汽性能的影响
• 3.2 戊二醛用量对支架材料理化性能的影响
• 3.3 酶处理对支架材料孔隙率和透水汽性能的影响
• 4 小结
• 第三章 新型胶原真皮支架纯度的测定
• 1 前言
• 2 实验部分
• 3 结果与讨论
• 3.1 羟脯氨酸标准曲线
• 3.2 盐酸用量对羟脯氨酸含量测定的影响
• 3.3 水解时间对羟脯氨酸含量测定的影响
• 3.4 重现性实验
• 3.5 新型胶原真皮支架的纯度
• 4 小结
• 第四章 新型胶原真皮支架的性能检测
• 1 前言
• 2 实验部分
• 3 结果和讨论
• 3.1 性状观察
• 3.2 HE染色光镜观察
• 3.3 SEM观察微观结构
• 3.4 主要理化性能
• 3.5 细胞毒性
• 3.6 细胞相容性
• 4 小结
• 全文总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文和研究成果
• 学位论文评阅及答辩情况表