丝状真菌尖镰孢Fusarium oxysporum L19嗜热内切葡聚糖酶的研究

论文摘要

纤维素作为植物细胞壁的主要成份，是自然界中最丰富的可再生性资源。微生物对纤维素的降解是自然界中碳素循环的主要途径，对这个过程的有效利用是解决资源匮乏的重要手段。然而，纤维素的应用研究一直进展缓慢。纤维素酶催化反应的低效率及其在催化过程中的变性失活致使其成本在总成本中的比重居高不下，是生物质转化和有效利用的限制性瓶颈。将纤维素作为低值、环境友好型的资源来利用，仍然存在多方面的限制。为增强酶的稳定性，大量的嗜热性、耐碱性、耐酸性等极端纤维素酶相继得到研究，但还很少进入实用，这是因为极端酶本身的催化效率存在局限性。从酶催化反应动力学角度分析，影响酶催化速率的主要因素除了酶和底物自身之外，还包括催化环境的影响，其中温度和酸碱度是最重要的环境变量之一。事实上，在普遍采用的“最适温度”下，酶的催化活性与热稳定性之间存在矛盾，依此为据所确定的反应温度致使酶的实际使用寿命缩短，大大的增加了生物工程中酶的成本。由于酶蛋白结构稳定性的影响导致通常所定义的最适pH两侧出现非正态分布，而限制了pH对[H+]表征的可靠性，造成很多误解。本论文针对上述存在的问题，通过对中温纤维分解真菌Fusarium oxysporum L19胞外嗜热及中温内切葡聚糖酶的比较研究，分析了不同温度下两种内切葡聚糖酶的反应特性、合成酶的共同诱导机制以及水解纤维素的协同作用；探讨了嗜热内切葡聚糖酶的耐热机制；揭示了嗜热酶催化效率与稳定性之间的关系；基于对动力学过程的分析，指出了通常采用的表征酶“最适温度”、“最适pH”和热稳定性的方法的局限性，建立了新的表征温度对酶催化动力学和热稳定性影响的新方法，对用pH和[H+]表征酶催化动力学过程曲线的变化进行了比较，有一定创新性的结果。 1．发现中温菌Fusarium oxysporum L19可分泌多种嗜热内切葡聚糖酶和中温内切葡聚糖酶的现象。 F．oxysporum L19是一株典型的中温真菌，具有完整纤维素降解酶系而无木素降解酶。经过初步的分离纯化发现，该菌胞外液中至少含有四种中温内切葡聚糖酶和三种

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摘要

ABSTRACT

缩写词表

研究背景

第一章 Fusarium oxysporum L19的分离和鉴定

1.1 材料与方法

1.2 结果与讨论

1.2.1 L19的培养特征及形态特征

1.2.2 L19的木质纤维素降解酶系

1.2.3 温度对F.oxysporum L19生长的影响

1.2.4 F.oxysporum L19生长曲线

1.3 结论

第二章 F.oxysporum L19的胞外纤维素酶系

2.1 材料与方法

2.2 结果与讨论

2.2.1 F.oxysporum L19的胞外纤维素酶系

2.2.2 F.oxysporum L19胞外粗酶对纤维素材料的降解

2.2.3 F.oxysporum L19纤维素酶的温度反应特性

2.2.4 诱导条件对F.oxysporum L19内切葡聚糖酶合成的影响

2.2.5 F.oxysporum L19内切葡聚糖酶的HPLC和复性电泳分析

2.3 结论

第三章 F.oxysporum L19内切葡聚糖酶嗜热组分EGt和中温组分EGm的分离纯化及性质

3.1 材料与方法

3.2 结果与讨论

3.2.1 嗜热（thermophilic）和中温（mesophilic）内切葡聚糖酶的纯化

3.2.2 EGt和EGm的酶学性质测定

3.2.3 EGt和EGm的二级结构分析

3.2.4 EGt和EGm的三级结构简析

3.2.5 EGt和EGm的协同作用

3.3 结论

第四章 EGt的cDNA克隆及序列分析

4.1 材料与方法

4.2 结果与讨论

4.2.1 RT-PCR引物的设计

4.2.2 总RNA的提取

4.2.3 RT-PCR扩增EGt的cDNA

4.2.4 克隆产物的验证

4.2.5 PCR扩增增加N-末端7个氨基酸

4.2.6 PCR扩增在cDNA末端引入限制性核酸内切酶酶切位点

4.2.7 EGt cDNA的测序和分析

4.2.8 与已知纤维素酶的基因编码序列的比较

4.2.9 EGt在E.coli中外源表达的探索

4.2.10 EGt的嗜热机理分析

4.3 结论

第五章表征温度对内切纤维素酶催化动力学及热稳定性影响的新方法

5.1 材料与方法

5.2 结果

mean)和瞬变速率(V_inst)的影响'>5.2.1 温度对EGm和EGt平均速率(V_mean)和瞬变速率(V_inst)的影响

5.2.2 用Gaussian方程拟合酶温度作用曲线

5.2.3 温度对EGm和EGt的热稳定性的影响

5.2.4 温度对EGm和EGt构象的影响

5.2.5 温度对EGm和EGt二级结构的影响

5.3 讨论

5.3.1 数值微分-积分法（Differential—Integral method）全面分析温度对酶催化动力学的影响

5.3.2 温度对内切酶催化反应动力学特性的影响存在对称性和对称性中断的特点

5.3.3 酶的最适温度

5.3.4 嗜热酶对高温环境的适应性

+]对内切葡聚糖酶活力影响的比较'>第六章 pH及[H⁺]对内切葡聚糖酶活力影响的比较

6.1 材料与方法

6.2 结果

+]对确定最适pH的影响'>6.2.1 pH和[H⁺]对确定最适pH的影响

+]对EGm稳定性的影响'>6.2.2 pH及[H⁺]对EGm稳定性的影响

+]两种表征方法确定酶酸碱特性'>6.2.3 pH与[H⁺]两种表征方法确定酶酸碱特性

6.3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

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