水稻多重颖壳突变体候选基因的表达与功能分析

论文摘要

水稻花器官发育的结果与水稻的产量与品质密切相关,但目前对其花发育的遗传机制并不清楚。本课题组在水稻育种材料中发现了两种雌雄蕊完全退化的突变体psd1（pistil-stamen degeneration）和psd2。通过精细定位,已确定PSD1的候选基因为一个OsMADS类转录因子基因,而PSD2的候选基因是两个磷酸酯酶基因,分别命名为TG1（triacylglycerol lipase）和TG2。在此基础上,本研究构建了PSD2的两个侯选基因的互补载体、过量表达载体和干扰载体,并进行遗传转化,目前已获得了部分转基因植株。同时,还利用扫描电镜分析psd1和psd2的花器官发育过程中的结构特征;利用组织原位杂交分析PSD1和PSD2时空表达特征。本研究为阐明PSD1和PSD2的具体功能奠定了基础。主要结果如下:1.构建了PSD2的两个侯选基因的互补实验载体pCV-TG1和pCV-TG2。分别克隆TG1启动子（1954bp）和开放阅读框（ORF）,然后连接入经改造过的pCAMBIA1301载体,得到pCV-TG1。克隆TG2完整序列（含803 bp启动子序列）,然后连接入pCAMBIA1300载体,得到pCV-TG2。用pCV-TG1和pCV-TG2转化水稻,已获得转基因苗,部分已移栽大田。2.构建了PSD2的两个侯选基因的过量表达载体pOV-TG1和pOV-TG2。利用改造过的pCAMBIA1301载体,分别将TG1和TG2的ORF序列插入到该载体中的35S启动子下游的多克隆位点,得到pOV-TG1和pOV-TG2。用pOV-TG1和pOV-TG2转化水稻,已获得了转基因苗,部分已移栽大田。3.利用PTCK303载体,构建了PSD2的两个侯选基因的RNAi载体pTCK-TG1和pTCK-TG2,所用干扰序列的大小分别为580bp和255bp。用pTCK-TG1和pTCK-TG2转化水稻,分别获得25和24株转基因苗。前者已移栽大田,而后者已抽穗,其中有5株部分小穗的一个副颖延长,表型与eg突变体类似,而与psd2突变体不一致。据此初步推测,TG2不是PSD2基因。4.扫描电镜分析表明,psd1和psd2的雌、雄蕊原基完全退化,被多层稃片原基取代。两者不同的是,psd1增生的稃片原基呈轮状分布,每一轮大约6个,而psd2增生的稃片原基呈对称分布,每一轮2个。5.RNA组织原位杂交结果表明,在颖花原基中的内外稃开始分化时,PSD1在其中央就有较强表达量;自桨片原基、雄蕊原基和雌蕊原基开始分化至分化完成,PSD1在雄蕊中持续强表达,而在桨片和雌蕊中表达量则由弱变强;至花器官发育基本完成后,仍能在桨片、雄蕊和雌蕊中检测到较强的表达量。而PSD2的表达情况为在内外稃原基已分化、桨片原基和雄蕊原基起始分化时,PSD2在整个小花原基中都有表达,但内外稃原基表达较弱,而在桨片原基和未分化的第三、四轮则有较强表达量;自雄蕊、雌蕊原基开始分化到分化完成,PSD2在桨片、雄蕊和雌蕊中持续表达;至花器官基本形成后,PSD2停止表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献综述
• 1.花的发育概述
• 2.水稻的发育过程及花的结构
• 3.花器官的发育及花发育的模型
• 3.1 单子叶植物水稻与双子叶植物花器官结构的比较
• 3.2 花器官发育模型的研究进展
• 3.2.1 经典的ABC模型
• 3.2.2 ABCD模型
• 3.2.3 ABCDE模型
• 3.2.4 四因子模型
• 3.2.5 MADS基因与花器官发育的关系
• 3.2.6 MADS转录因子的调控
• 4.水稻中花发育调控的相关基因
• 5.磷酸脂酶在花器官发育中的作用
• 6.研究基因表达的实验技术
• 6.1 原位杂交研究基因的时空表达
• 6.2 基因芯片研究基因的表达
• 7.水稻基因功能分析的方法
• 7.1 RNA干扰
• 7.2 超表达和基因诱导表达
• 7.3 转基因植株中外源DNA整合的遗传效应
• 8.本论文研究的目的及意义
• 材料与方法
• 1.实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 常用分子生物学载体与试剂
• 2.实验方法
• 2.1 PSD2候选基因TG1和TG2互补载体的构建
• 2.1.1 候选基因TG1互补载体pCV-TG1的构建
• 2.1.2 候选基因TG2互补载体pCV-TG2的构建
• 2.2 PSD2候选基因TG1和TG2过量表达载体的构建
• 2.2.1 构建PSD2候选基因TG1、TG2过量表达载体的策略
• 2.2.2 候选基因TG1、TG2过量表达载体pOV-TG1和pOV-TG2的构建
• 2.3 PSD2候选基因TG1、TG2干扰载体PTCK-TG1和PTCK-TG2的构建
• 2.3.1 干扰载体pTCK-TG1和pTCK-TG2的构建策略
• 2.3.2 干扰载体pTCK-TG1、pTCK-TG2反向序列的接入
• 2.3.3 干扰载体pTCK-TG1、pTCK-TG2正向序列的接入
• 2.4 水稻愈伤组织的遗传转化
• 2.4.1 侵染成熟胚愈伤的方法
• 2.4.2 培养基
• 2.5 扫描电镜分析
• 2.6 原位杂交分析
• 2.7 验证PSD1和PSD2候选基因关系的研究方法
• 结果与分析
• 1.PSD2候选基因TG1、TG2互补载体的构建及遗传转化
• 1.1 互补载体PCV-TG1的构建及遗传转化
• 1.2 互补载体PCV-TG2的构建及遗传转化
• 2.PSD2候选基因TG1、TG2过量表达载体的构建及遗传转化
• 2.1 过量表达载体POV-TG1的构建及遗传转化
• 2.2 过量表达载体POV-TG2的构建及遗传转化
• 3.PSD2候选基因TG1、TG2干扰载体的构建及遗传转化
• 3.1 干扰载体PTCK-TG1的构建及遗传转化
• 3.2 干扰载体PTCK-TG2的构建及遗传转化
• 4.扫描电镜结果分析
• 4.1 水稻花器官的发育过程
• 4.2 PSD1小花的发育特征
• 4.3 PSD2小花的发育特征
• 5.原位杂交研究PSD1和PSD2的时空表达过程
• 5.1 PSD1的时空表达分析
• 5.2 PSD2候选基因TG1的时空表达分析
• 6.PSD1和PSD2候选基因相互关系的验证
• 讨论
• 1.PSD1基因是水稻花器官形态建成的控制基因
• 2.PSD2是另一类水稻花器官形态建成的控制基因
• 3.影响RNA干扰效果的因素
• 4.下一步的工作
• 参考文献
• 附录
• 附录1.载体构建中所用到的基本实验方法以及相关溶液的配制
• 附录2.原位杂交步骤及相关试剂的配制
• 附录3.转基因培养基的配方
• 致谢